本文選題：氣道剪應(yīng)力 + 黏蛋白5AC　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：目的：探討氣道剪應(yīng)力（SS）作用下黏蛋白（MUC）5AC胞外極向分泌的主要介導(dǎo)機(jī)制。 方法： (1)采用Cortactin-siRNA-pSilencer3.1-H1/neo表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Cortactin-siRNA抑制Cortactin功能，并用Western印跡法檢測(cè)目標(biāo)序列組與對(duì)照序列組的Cortactin水平，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 (2)采用節(jié)律性旋轉(zhuǎn)裝置模擬呼吸時(shí)氣流介導(dǎo)的SS。該裝置旋轉(zhuǎn)過(guò)程中通過(guò)加速/減速交替進(jìn)行的方式模擬呼吸過(guò)程中吸氣/呼氣對(duì)氣道的牽拉作用即為剪應(yīng)力。為模擬病理狀態(tài)下氣流對(duì)氣道上皮細(xì)胞的SS作用，，我們把加速/減速的時(shí)間設(shè)置為1.2s/次，30次/min。每組作用30min。 (3)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)以5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在6孔硅膠培養(yǎng)皿上并置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%左右，使用Stata軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)組隨機(jī)分為5組：A組(空白對(duì)照組)；B組(SS組)；C組(SS+Rac-1特異性抑制劑組）；D組(SS+F-actin解聚劑組)；E組（SS+Cortactin-siRNA轉(zhuǎn)染組）；每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 (4)分別采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MUC5AC的胞外相對(duì)分泌量； Western印跡法檢測(cè)Cortactin及p-Cortactin的相對(duì)水平和轉(zhuǎn)染效果；激光共聚焦顯微鏡觀察F-actin聚合情況。 結(jié)果： (1)通過(guò)Western印跡法檢測(cè)目標(biāo)序列組與對(duì)照序列組的Cortactin相對(duì)表達(dá)水平后確認(rèn)Cortactin-siRNA-pSilencer3.1-H1/neo表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 (2) ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中MUC5AC水平：與A組（0.210±0.013）相比，B組（0.631±0.025）MUC5AC胞外相對(duì)分泌水平顯著增加（P=0.000）；與B組相比，C組、D組和E組（0.473±0.112、0.330±0.067、0.272±0.019）MUC5AC胞外相對(duì)分泌水平均明顯降低（P=0.043、0.000、0.000）。 (3) Western印跡法檢測(cè)Cortactin及p-Cortactin的相對(duì)水平：B組Cortactin相對(duì)表達(dá)水平為（0.670±0.048），顯著高于E組的（0.132±0.014）（P＜0.01），但與A、C、D組的（0.641±0.016、0.622±0.012、0.653±0.027）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；B組p-Cortactin相對(duì)表達(dá)水平為（0.582±0.067），顯著高于A、C、E組的（0.131±0.011、0.393±0.045、0.170±0.016）（P=0.000、0.021、0.000），而D組（0.511±0.029）與B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.246）。 (4)激光共聚焦顯微鏡觀察F-actin聚合情況：A組幾乎沒(méi)有聚合狀態(tài)的F-actin，表現(xiàn)為無(wú)絲狀熒光出現(xiàn)；B組F-actin聚合程度高，呈平行排列、粗細(xì)均勻、長(zhǎng)短一致的絲狀熒光；C組F-actin聚合程度較B組略有減弱，絲狀熒光的平行排列稍顯紊亂、粗細(xì)稍欠均勻、長(zhǎng)短不一致；D組F-actin聚合程度顯著降低，絲狀熒光排列紊亂，無(wú)細(xì)長(zhǎng)的絲狀熒光；E組F-actin聚合程度明顯降低，絲狀熒光長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不均、排列紊亂。 結(jié)論： 在氣道SS作用下，通過(guò)激活Rac-1、Cortactin和F-actin而促進(jìn)MUC5AC胞外極向分泌，產(chǎn)生黏液高分泌的病理狀態(tài)。Rac-1、Cortactin和F-actin是SS作用下MUC5AC胞外極向分泌的主要介導(dǎo)分子。
[Abstract]:Aim: to investigate the mediating mechanism of extracellular polar secretion of MUC5 AC under the action of airway shear stress (SSSS). Methods: 1) Cortactin-siRNA-pSilencer3.1-H1/neo expression vector was used to transfect Cortactin-siRNA to inhibit the function of Cortactin. The level of Cortactin in target sequence group and control sequence group was detected by Western blotting, and the subsequent experiment was carried out after the transfection was successful. A rhythmic rotating device was used to simulate the airflow mediated SSs during respiration. In the process of rotation, shear stress is simulated by alternate acceleration and deceleration in the process of breathing, in which the pulling effect of inspiratory and exhalation on the airway is simulated. In order to simulate the SS effect of airflow on airway epithelial cells in pathological state, we set the acceleration / deceleration time to 30 1.2s/ min. Each group acted for 30 minutes. 3) Human bronchial epithelial cells were inoculated with 5 脳 10 5 cells / well on 6 well silica plates and cultured in 37 鈩

本文編號(hào)：1937140