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  本文關(guān)鍵詞：全血γ干擾素釋放實驗在菌陰肺結(jié)核和結(jié)核性胸膜炎中的診斷價值，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《河北醫(yī)科大學(xué)》 2007年

應(yīng)用ELISPOT技術(shù)檢測結(jié)核菌感染的研究

李嶠珂  

【摘要】： 目的:建立應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Enzyme Linked- immunospot Assay,ELISPOT)技術(shù)檢測結(jié)核菌感染的方法,初步研制酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試劑盒(簡稱自制試劑盒),并評價其在結(jié)核病診斷臨床中的應(yīng)用價值。 方法:選擇30例非結(jié)核感染志愿者,26例結(jié)核病人和4例結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)皮膚試驗強(qiáng)陽性、無任何結(jié)核病臨床癥狀且相關(guān)檢查結(jié)果無異常的志愿者,用英國Oxford Immunotec公司研制的T SPOT-TB試劑盒(簡稱T SPOT-TB試劑盒)檢驗。 根據(jù)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞在特異抗原的刺激下分泌γ-干擾素(IFN-γ),檢測IFN-γ可以確定體內(nèi)是否存在對結(jié)核桿菌反應(yīng)的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的原理,建立應(yīng)用ELISPOT技術(shù)檢測結(jié)核菌感染的方法。預(yù)先用IFN-γ單克隆抗體包被96孔硝酸纖維素膜板,用密度-梯度離心法分離被檢測者外周血單核細(xì)胞,加入96孔板中,用特異性重組ESAT-6蛋白和CFP10-ESAT6融合蛋白刺激,活化細(xì)胞,結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞將分泌IFN-γ,然后加入生物素標(biāo)記的IFN-γ多克隆抗體作為檢測抗體,再加入堿性磷酸酶(AKP)標(biāo)記的鏈親和素,加入底物BCIP/NBT溶液顯色,在板底形成肉眼可見的深藍(lán)色斑點(diǎn)。每一個斑點(diǎn)代表一個分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞。根據(jù)體內(nèi)是否存在結(jié)核桿菌效應(yīng)T淋巴細(xì)胞,對結(jié)核桿菌感染進(jìn)行輔助診斷。 改變不同的實驗條件確定應(yīng)用ELISPOT技術(shù)檢測結(jié)核桿菌感染方法的最佳細(xì)胞濃度、孵育時間,蛋白濃度等,初步研制自制ELISPOT試劑盒。選擇32例非結(jié)核感染志愿者和31例結(jié)核病人,均使用T SPOT-TB試劑盒和自制試劑盒進(jìn)行檢驗。將兩者檢測結(jié)果進(jìn)行對比。 結(jié)果:用T SPOT-TB試劑盒進(jìn)行檢驗,30例結(jié)核感染者的血樣本檢測結(jié)果93.3%(28/30)陽性,6.7%(2/30)陰性,30例非結(jié)核感染者檢測結(jié)果96.6%(29/30)陰性,3.4%(1/30)陽性。 改變不同的實驗條件來確定自制試劑盒的各個合適的實驗條件,結(jié)果表明:2×105細(xì)胞密度較為合適,孵育時間20h為實驗條件,刺激結(jié)核致敏T淋巴細(xì)胞的蛋白濃度20μg/ml為實驗條件。 用T SPOT-TB試劑盒和自制試劑盒對32例非結(jié)核感染者和31例結(jié)核病人進(jìn)行檢測,結(jié)果92.1%(58/63)T SPOT-TB試劑盒與自制試劑盒檢測結(jié)果相同,7.9%(5/63)結(jié)果不同。對兩種試劑盒檢出結(jié)果行χ2檢驗,兩者差異無顯著性(P0.05),說明兩種試劑盒對血樣陽性檢出率沒有顯著性差異。31例已確診結(jié)核病人檢測結(jié)果為:T SPOT-TB試劑盒87.1%(27/31)陽性,自制試劑盒90.3%(28/31)陽性。32例非結(jié)核感染者檢測結(jié)果為:T SPOT-TB試劑盒18.8%(6/32)陽性,自制試劑盒25.0%(8/32)陽性。自制試劑盒的敏感性略高于T SPOT-TB試劑盒。自制試劑盒的假陽性率高于后者,但因所選病歷中包括消化系統(tǒng)和血液腫瘤患者,以及老年人等免疫低下者,不排除其為結(jié)核潛伏感染者,因機(jī)體免疫力低下,對PPD實驗無反應(yīng)。故尚需進(jìn)一步的追蹤陽性病例是否發(fā)病。自制試劑盒痰菌陽性組檢測孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)顯著高于痰菌陰性組檢測孔(P0.05),說明痰菌陽性患者體內(nèi)特異性IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)有不同程度提高。 結(jié)論:英國Oxford Immunotec公司研制的T SPOT-TB試劑盒診斷結(jié)核病感染者的敏感度和特異性均較高;本研究建立了一種結(jié)核病細(xì)胞免疫診斷試劑盒,其診斷結(jié)核病感染者的敏感性和特異性與T SPOT-TB試劑盒相似,且操作簡便,花費(fèi)小;ELISPOT在檢測結(jié)核潛伏感染者敏感性和特異性均高于PPD皮膚試驗。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R446.6
【目錄】：

中文摘要3-6

英文摘要6-9

研究論文 應(yīng)用ELISPOT技術(shù)檢測結(jié)核菌感染的研究9-41

前言9-11

材料與方法11-20

結(jié)果20-23

附圖23-27

附表27-31

討論31-36

結(jié)論36-37

參考文獻(xiàn)37-41

綜述 ELISPOT——一種有效的免疫學(xué)檢測技術(shù)41-58

致謝58-59

個人簡歷59

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【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：181975