本文關(guān)鍵詞：哮喘小鼠CD8~+調(diào)節(jié)性T細胞的作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南方醫(yī)科大學(xué)》 2012年

荷瘤小鼠髓系來源抑制性細胞對CD8~+CD28~-細胞的調(diào)控及其在支氣管哮喘中的作用

廖原  

【摘要】：研究背景 目前,國內(nèi)外支氣管哮喘患病率逐漸上升,全世界支氣管哮喘患者約有1億人,已成為嚴(yán)重威脅人們健康的主要慢性疾病,而其發(fā)病機制尚未完全闡明。近年來,TH1/TH2平衡理論一直作為支氣管哮喘發(fā)病機制的核心。但是,研究表明,除外Th1和Th2細胞外,可能還存在著一個功能和細胞因子產(chǎn)生方面既不同于Thl也不同于Th2的T細胞亞型,稱為調(diào)節(jié)性T細胞(regIllatory Tcel1, Tr)。調(diào)節(jié)性T細胞主要包括：分泌高水平IL-10的Trl、分泌TGF-β為主的TH3及CD8+和CD4+調(diào)節(jié)性T細胞。在免疫調(diào)節(jié)過程中,CD4+調(diào)節(jié)性T細胞促發(fā)抑制作用的發(fā)生,而CD8+調(diào)節(jié)性T細胞是發(fā)揮抑制作用的效應(yīng)細胞。在CD8+調(diào)節(jié)性T細胞中,CD8+CD28調(diào)節(jié)性T細胞是的主要亞群,約占90%,其可抑制抗原提呈細胞共刺激分子CD80、CD86、CD54、CD58的表達。此外,該細胞也可抑制輔助性T細胞NF-KB(核因子kB)的激活、抑制共刺激分子的轉(zhuǎn)錄、阻止輔助性T細胞膜上CD40L分子的表達、抑制輔助性T細胞對MHC-Ⅰ類分子抗原的反應(yīng)活性。越來越多的證據(jù)表明,CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞與哮喘變態(tài)反應(yīng)性炎癥及外周維持機體自身免疫耐受有著一定的關(guān)系。上調(diào)哮喘患者CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量或功能、糾正其免疫失調(diào)或?qū)⒊蔀橄委煹男虏呗浴? 髓系來源抑制性細胞(Myeloid derived suppressor cells MDSC)為近年來研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者體內(nèi)聚積的一類與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)的髓樣細胞,由不同分化階段的髓系細胞如單核細胞、粒細胞、未成熟細胞等組成。最早于1970年,意大利腫瘤學(xué)家利用腫瘤疫苗進行防治腫瘤的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)此種腫瘤疫苗對于腫瘤的生長沒有抑制作用。十余年后,他們在美國繼續(xù)這項研究時發(fā)現(xiàn)在腫瘤動物中存在具有免疫抑制作用的細胞—MDSC。90年代末,Gabrilovich等在研究為何腫瘤疫苗不能阻止腫瘤組織生長時,發(fā)現(xiàn)腫瘤動物的脾臟中存在MDSC,此細胞群超過40%,比正常人群高3-5倍,而樹突狀細胞的數(shù)量則明顯下降。MDSC還可在荷瘤小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞Foxp3的表達,上調(diào)CD4+、CD8+調(diào)節(jié)性T細胞的比例,引起免疫無能和抑制。研究發(fā)現(xiàn)MDSC的免疫抑制功能與其來源有關(guān),往往只有從患瘤鼠或腫瘤患者體內(nèi)分離到的這類細胞才具有免疫抑制功能,而用同樣方法從正常鼠或人分離的同類細胞則不具有抑制功能。近年來,MDSC已經(jīng)成為自身免疫疾病、腫瘤、器官移植等疾病領(lǐng)域研究的熱點問題。然而,其細胞特性、免疫調(diào)節(jié)功能及其在哮喘中作用研究較少。 本實驗以荷瘤小鼠為研究對象,采用二次磁珠分離法來分離,純化,體外培養(yǎng)活化的MDSC,并通過過繼轉(zhuǎn)移MDSC直接十預(yù)哮喘動物的氣道炎癥反應(yīng),檢測小鼠外周血CD8+CD28-T細胞比例。觀察MDSC是否可以干預(yù)哮喘發(fā)作,同時觀察MDSC對CD8+調(diào)節(jié)性T細胞的調(diào)控,探討可能的作用機制。 第一部分小鼠哮喘模型建立 目的建立OVA致敏和激發(fā)的雌性BALB/c小鼠哮喘模型 方法SPF級雌性BALB/c小鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)20只,4-6周齡,體重18-20g,隨機分為2組,每組10只,A組為正常對照組,B組為哮喘模型組。B組小鼠于實驗流程第0、14d、21d給予腹腔注射含OVA2mg和乳化氫氧化鋁5mg的生理鹽水混懸液200μl致敏；第28d開始先給予1%OVA生理鹽水200μl滴鼻激發(fā),隨后給予2%OVA生理鹽水霧化液40ml經(jīng)超聲霧化器霧化吸入,每天1次,每次持續(xù)約30min,連續(xù)7d。A組以生理鹽水替代致敏液及霧化液,方法同B組。誘發(fā)小鼠哮喘后第7天,摘取小鼠眼球放血后處死,兩組小鼠各隨機選取6只行支氣管肺泡灌洗術(shù)。將回收的BALF涂片,固定,HE染色,光學(xué)顯微鏡下計數(shù)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞數(shù),中性粒細胞數(shù)。兩組小鼠各自隨機選取4只行開胸取肺組織,置于10%中性甲醛固定液中固定。常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、制備石蠟切片、HE染色、中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)、氣道上皮損傷、氣管及血管周圍嗜酸性粒細胞浸潤情況。 結(jié)果1.致敏、激發(fā)過程小鼠行為學(xué)觀察：模型組小鼠出現(xiàn)不同程度的扭體反應(yīng)、立毛,頭面部瘙癢,前肢搔鼻,煩躁不安,然后俯伏不動,口唇紫紺,呼吸急促,腹肌抽搐,二便失禁等癥狀；而正常組小鼠無此陽性癥狀。 2. BALF中細胞總數(shù)和分類比較：①BALF細胞總數(shù)：A組BALF細胞總數(shù)為(6.75±52.70)×104/ml,B組BALF細胞總數(shù)為(34.05±8.62)×104/ml,B組BALF細胞總數(shù)顯著高于A組(t=-9.557,P=0.006)。②BALF(?)耆酸性粒細胞：A組和B組BALF(?)耆酸性粒細胞數(shù)分別為(1.35±0.96)×104/ml和(10.85±3.14)×104/ml,B組BALF(?)耆酸性粒細胞數(shù)顯著高于A組(t=-8.378,P=0.004)。③BALF中性粒細胞數(shù)：A組和B組BALF中性粒細胞數(shù)分別為(1.56±0.82)×104/ml和(9.78±2.65)×104/ml,B組BALF中性粒細胞數(shù)顯著高于A組(t=-9.450,P=0.002)。 3.肺組織病理變化：哮喘模型組支氣管及血管周圍大量炎性細胞浸潤,肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞浸潤,可見氣道上皮損傷、結(jié)構(gòu)紊亂、氣道內(nèi)杯狀細胞肥大增生,氣道內(nèi)分泌大量黏液并有粘液栓形成,粘膜下膠原纖維沉積。對照組肺組織氣道結(jié)構(gòu)清晰,氣道纖毛上皮排列整齊,無明顯的炎癥改變及膠原纖維沉積。 結(jié)論雌性BALB/c小鼠經(jīng)OVA和乳化的氫氧化鋁腹腔注射致敏后,采用滴鼻聯(lián)合霧化激發(fā)的方法成功建立小鼠哮喘模型,更加符合哮喘氣道的病理生理改變。 第二部分MDSC對哮喘小鼠氣道炎癥的影響及CD8+CD28調(diào)節(jié)性T細胞的調(diào)控作用 目的 觀察MDSC對哮喘小鼠氣道炎癥的影響及CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞的調(diào)控作用,探討可能的機制 方法 SPF級BALB/c小鼠35只,其中6周齡雄鼠5只,用于制備髓系來源抑制性細胞：6周齡雌鼠30只,隨機分為正常對照組(A組)、哮喘組(B組)細胞移植組(C組),10只/組。采用免疫磁珠技術(shù)分選腫瘤小鼠骨髓中的MDSCs,在粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的誘導(dǎo)下外擴增培養(yǎng),通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),流式細胞術(shù)檢測其表型及其表達率。B、C兩組予OVA腹腔注射致敏、OVA霧化誘發(fā)哮喘,C組在誘導(dǎo)哮喘的第10天經(jīng)尾靜脈注入免疫磁珠分選提純的髓源性抑制細胞。HE染色觀察小鼠肺部病理改變,計數(shù)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)。流式細胞術(shù)檢測小鼠外周血中CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞占淋巴細胞的百分比,分析C組BALF中嗜酸性粒細胞與外周血中CD8+CD28調(diào)節(jié)性T細胞百分比的相關(guān)性 結(jié)果 1.小鼠行為學(xué)觀察B組小鼠出現(xiàn)不同程度的扭體反應(yīng)、立毛,頭面部瘙癢,前肢搔鼻,煩躁不安,然后俯伏不動,口唇紫紺,呼吸急促,腹肌抽搐,二便失禁等癥狀：A組小鼠無此癥狀,C組小鼠偶有此癥狀。 2. BALF中細胞總數(shù)及中性粒細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)比較BALF中細胞總數(shù)和分類比較：①BALF細胞總數(shù)：A組BALF細胞總數(shù)為(6.75±2.70)×104/ml,B組BALF細胞總數(shù)為(34.05±8.02)×104/ml,C組BALF細胞總數(shù)為(17.39±3.49)×104/ml,B和C組BALF細胞總數(shù)顯著高于A組(P0.01),C組明顯低于B組(P0.01)②BALF(?)(?)酸性粒細胞和中性粒細胞數(shù)：A組BALF(?)(?)酸性粒細胞和中性粒細胞數(shù)分別為(1.35±0.96)×104/ml和(1.56±0.82)×104/ml,B組BALF嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數(shù)分別為和(9.78±2.65)×104/ml和(10.85±3.14)×104/ml,C組BALF嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數(shù)分別為和(4.16±1.53)×104/ml和(6.99±2.07)×104/ml,B組和C組BALF嗜酸性粒細胞和中性粒細胞顯著高于A組(P0.01),C組嗜酸性粒細胞和中性粒細胞比例明顯低于B組(P0.01)。 3.肺組織病理學(xué)變化A組小鼠：小氣管上皮黏膜完整,周圍肺組織基本無炎癥細胞浸潤。B組小鼠：支氣管、血管黏膜下和周圍肺組織有明顯的炎癥細胞浸潤。以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞為主,可見杯狀細胞增生。C組小鼠：與哮喘組相比,支氣管、血管黏膜下和周圍肺組織炎癥明顯減輕。 4.流式細胞術(shù)檢測外周血CD8+CD28—T細胞：哮喘組為(6.0±1.9)%,顯著低于正常對照組的(11.1±3.8)%和細胞移植組(8.8±2.1)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.791,P0.05),細胞移植組與正常對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.336)。 5.細胞移植組小鼠BALF中EOS與外周血CD8+CD28-T細胞作Pearson相關(guān)分析示：細胞移植組BALF中嗜酸性粒細胞計數(shù)均與外周血中CD8+CD28—T細胞百分比呈顯著負相(r=-0.709,P=0.022)。 結(jié)論靜脈輸注荷瘤小鼠髓系來源抑制性細胞可上調(diào)哮喘小鼠外周血CD8+CD28調(diào)節(jié)性T細胞比例,并且一定程度上可抑制哮喘小鼠氣道炎癥。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R562.25
【目錄】：

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8 王振嶺;[N];中國醫(yī)藥報;2009年

9 曉魚;[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2010年

10 李娜;[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2009年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 江宏;支氣管哮喘動態(tài)監(jiān)測和癥狀感知模型的建立[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

2 吳小慧;支氣管哮喘相關(guān)基因的多態(tài)性研究[D];華中科技大學(xué);2010年

3 李開艷;Th17細胞亞群在支氣管哮喘中的發(fā)病機制及TLR2對Th17細胞分化的調(diào)控研究[D];華中科技大學(xué);2011年

4 李四維;芪味理肺湯調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1（AP-1）治療支氣管哮喘的機制研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2014年

5 朱燦紅;HO-1基因轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細胞在支氣管哮喘中的作用及機制研究[D];蘇州大學(xué);2014年

6 吳思怡;宣肺化痰結(jié)合益氣固衛(wèi)防治支氣管哮喘發(fā)作的臨床研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

7 許麗梅;宣肺化痰活血法治療支氣管哮喘的療效觀察及其對LTD4、NGF的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2012年

8 王雯;IL-4、β_2-AR基因多態(tài)性及ECP、IgE與維吾爾族支氣管哮喘的關(guān)系[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2003年

9 佟萬成;熱休克蛋白70、90α、90β mRNA在支氣管哮喘與慢性支氣管炎患者外周血單個核細胞中的表達研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1997年

10 郝月琴;平哮合劑治療支氣管哮喘的臨床及實驗研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2003年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳曉琴;IL-4受體α鏈基因多態(tài)性與支氣管哮喘相關(guān)性的研究[D];暨南大學(xué);2003年

2 王金東;舍曲林輔助治療伴有抑郁的青少年支氣管哮喘的療效及血清IL-4變化的研究[D];山東大學(xué);2010年

3 殷楚芬;馬鳳彬主任醫(yī)師治療支氣管哮喘臨證經(jīng)驗整理[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2011年

4 陳濤;遵義市支氣管哮喘患兒過敏原皮膚點刺試驗檢測結(jié)果分析[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2010年

5 侯長春;促炎癥細胞因子HMGB1在支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病表達變化和臨床意義[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

6 王嬌;麻黃水提物霧化吸入對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥的影響[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2011年

7 高丹;支氣管哮喘的臨床經(jīng)絡(luò)診察研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

8 王澤宇;CCL1-CCR8在小鼠支氣管哮喘發(fā)病機制中的作用及地塞米松對其作用的影響[D];鄭州大學(xué);2010年

9 齊雙輝;小兒哮咳喘膠囊調(diào)節(jié)支氣管哮喘免疫平衡的實驗研究[D];長春中醫(yī)藥大學(xué);2010年

10 劉超;兒童支氣管哮喘急性發(fā)作的病原分布特點分析[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：哮喘小鼠CD8~+調(diào)節(jié)性T細胞的作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：179952