本文選題：哮喘 + ASMC��； 參考：《暨南大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：氣道重塑是支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）的一個(gè)重要病理特征，，但其具體發(fā)生機(jī)制尚不明確。整合素（Integrin）是一種由α、β亞單位組成的二聚體糖蛋白，能通過(guò)獨(dú)特的信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡等多個(gè)生理過(guò)程�，F(xiàn)已證實(shí)，Integrin-β1廣泛存在于氣道平滑肌細(xì)胞（ASMC）表面，并能調(diào)控ASMC多個(gè)重要的生理過(guò)程，故可能對(duì)哮喘氣喘重塑有重要影響。本研究通過(guò)構(gòu)建靶向沉默小鼠Integrin-β1的shRNA表達(dá)載體，從體外、體內(nèi)水平探討Integrin-β1在哮喘氣道重塑中的作用及其信號(hào)調(diào)控機(jī)制，從而確定哮喘治療的新靶點(diǎn)。 第一部分整合素-β1對(duì)哮喘氣道重塑的影響 目的探討Integrin-β1對(duì)哮喘氣道重塑的影響。 方法設(shè)計(jì)并合成靶向小鼠Integrin-β1基因的shRNA表達(dá)載體，分別體外、體內(nèi)轉(zhuǎn)入哮喘小鼠模型ASMC，免疫熒光法檢測(cè)體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR及Real-time PCR法檢測(cè)體外干預(yù)前后Integrin-β1mRNA表達(dá)變化；Western-blot法檢測(cè)體外干預(yù)前后Integrin-β1蛋白表達(dá)變化；CCK-8法、BrdU ELISA法及流式細(xì)胞儀法檢測(cè)體外干預(yù)前后ASMC增殖率及細(xì)胞周期分布時(shí)相的變化；Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測(cè)體外干預(yù)前后ASMC凋亡的變化；Transwell法檢測(cè)體外干預(yù)前后ASMC遷移率的變化；ELISA法檢測(cè)體外干預(yù)前后IL-6、IL-8的含量變化；肺組織病理切片觀察體內(nèi)干預(yù)前后哮喘小鼠模型氣道重塑變化。 結(jié)果shRNA表達(dá)載體能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哮喘小鼠ASMC，體外轉(zhuǎn)染后的Integrin-β1的mRNA及其蛋白質(zhì)水平均顯著下調(diào)（P均0.05）；細(xì)胞增殖率減低（P0.05），G0/G1期細(xì)胞比例增加（P0.05），S期細(xì)胞比例降低（P0.05）；細(xì)胞凋亡率明顯升高（P0.05）；此外，細(xì)胞遷移速率及IL-6、IL-8的含量則顯著降低（P均0.05）；體內(nèi)轉(zhuǎn)染后的哮喘小鼠模型的氣道重塑情況有所減輕。 結(jié)論Integrin-β1能促使ASMC過(guò)度增殖、凋亡減緩、細(xì)胞遷移加速、炎癥介質(zhì)IL-6及IL-8分泌增多，引起氣道平滑肌層增厚，是導(dǎo)致哮喘氣道重塑形成的重要原因。 第二部分整合素-β1在哮喘ASMC增殖信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的作用及shRNA靶向干預(yù)研究 目的探討Integrin-β1對(duì)小鼠慢性哮喘模型ASMC增殖信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控及shRNA靶向干預(yù)作用。 方法構(gòu)建靶向小鼠Integrin-β1基因的shRNA表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)入哮喘小鼠模型ASMC，免疫熒光法檢測(cè)體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR及Real-time PCR法檢測(cè)干預(yù)前后CyclinD1、c-Fos的mRNA表達(dá)變化；Western-blot法檢測(cè)干預(yù)前后ERK1/2、STAT6、p-ERK1/2、p-STAT6、CyclinD1及c-Fos的蛋白表達(dá)變化；CCK-8法、BrdU ELISA法及流式細(xì)胞儀法檢測(cè)干預(yù)前后ASMC增殖率及細(xì)胞周期時(shí)相分布的變化。 結(jié)果shRNA表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哮喘小鼠ASMC后，CyclinD1和c-Fos的mRNA及其相應(yīng)蛋白質(zhì)水平均顯著下調(diào)（P均0.05），ERK1/2、STAT6蛋白表達(dá)未改變（P均0.05），p-ERK1/2蛋白表達(dá)降低（P0.05），而p-STAT6蛋白表達(dá)增高（P0.05）；體外轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖率顯著減低（P0.05），細(xì)胞周期阻滯在G0/G1時(shí)相中（P0.05）。 結(jié)論哮喘ASMC內(nèi)Integrin-β1/ERK1/2通路與IL-4/IL-13/STAT6通路間存在交互應(yīng)答，而Integrin-β1能提高這兩條通路的胞核內(nèi)靶分子CyclinD1及c-Fos活性，可能是ASMC增殖信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的“分子開(kāi)關(guān)”及影響哮喘氣道重塑的作用機(jī)制所在；shRNA表達(dá)載體能靶向抑制Integrin-β1基因表達(dá)，可望成為哮喘氣道重塑基因治療的有效手段。
[Abstract]:The airway remodeling of bronchial asthma (asthma) is one of the important pathological features, but its pathogenesis is still unclear. Integrin (Integrin) is an alpha, two dimer glycoprotein beta subunit composition, through the unique signal transduction pathways regulating cell growth, differentiation, proliferation, apoptosis and many other the physiological process. It has been confirmed that Integrin- beta 1 exists in airway smooth muscle cells (ASMC) surface, and can regulate the ASMC of a number of important physiological processes, it may have an important impact on asthma asthma remodeling. This study builds the target expression vector to silence shRNA mice Integrin- beta 1 from in vitro, in vivo levels of Integrin- beta 1 in airway remodeling in asthma and its signal regulation mechanism, so as to determine a new target to treat asthma.
The effect of integrin - beta 1 on airway remodeling in asthma
Objective to investigate the effect of Integrin- beta 1 on airway remodeling in asthma.
Methods we designed and synthesized the target expression vector to mouse Integrin- beta 1 gene shRNA respectively in vitro, in vivo into a mouse model of asthma ASMC detection in vivo transfection efficiency of immunofluorescence, expression of Integrin- beta 1mRNA detected before and after the intervention in vitro RT-PCR and Real-time PCR; expression of Integrin- beta 1 protein were detected before and after in vitro Western-blot assay; CCK-8 BrdU method, ELISA method and flow cytometry before and after intervention in vitro detection method ASMC proliferation rate and cell cycle distribution of the phase change; Annexin V-PE/7-AAD double staining changes of ASMC apoptosis assay in vitro before and after intervention; changes of ASMC migration rate before and after intervention by Transwell in vitro; in vitro by ELISA IL-6 detected before and after the intervention, the content of IL-8; changes of airway remodeling in asthmatic mice lung tissue sections were observed before and after intervention.
Results shRNA expression vector can stably transfected asthmatic mice ASMC in vitro after transfection of Integrin- beta 1 and mRNA protein levels were significantly decreased (P < 0.05); reduce the rate of cell proliferation (P0.05), the proportion of cells in G0/G1 phase increased (P0.05), the proportion of cells in S phase decreased (P0.05); the apoptosis rate increased significantly (P0.05); in addition, cell migration rate and IL-6, the content of IL-8 decreased significantly (P < 0.05); airway remodeling in asthmatic mice model in vivo after some relief.
Conclusion Integrin- beta 1 can induce excessive proliferation of ASMC, slow down apoptosis, accelerate cell migration, increase secretion of IL-6 and IL-8 in inflammatory mediators, and cause thickening of airway smooth muscle layer, which is the important cause of airway remodeling in asthma.
The role of the second part integrin beta 1 in the ASMC proliferation signal network of asthma and the study of shRNA targeting intervention
Objective to investigate the effect of Integrin- beta 1 on the regulation of ASMC proliferation signal network and the targeted intervention of shRNA in mice with chronic asthma model.
Methods expression vector to mouse Integrin- beta 1 gene shRNA in vitro to construct target, a mouse model of asthma ASMC detection in vivo transfection efficiency of immunofluorescence, RT-PCR and Real-time were detected before and after intervention by PCR CyclinD1, the expression of c-Fos mRNA detected before and after the intervention of Western-blot; ERK1/2, STAT6, p-ERK1/2, p-STAT6, CyclinD1 and c-Fos expression protein; CCK-8 method, BrdU ELISA method and proliferation rate of ASMC flow cytometry detected before and after the intervention and the distribution of cell cycle changes.
Results shRNA expression vector transfected asthmatic mice after ASMC, CyclinD1 and c-Fos mRNA and their protein levels were significantly lower (P 0.05), ERK1/2, STAT6 protein expression did not change (P < 0.05), lower expression of p-ERK1/2 (P0.05), and the expression of p-STAT6 protein (P0.05); significantly reduce the rate of transfection in vitro after the cell proliferation (P0.05), cell cycle arrest in G0/G1 phase (P0.05).
Conclusion ASMC in asthma exist interactive response Integrin- beta 1/ERK1/2 pathway and IL-4/IL-13/STAT6 pathway, and Integrin- beta 1 can improve the two pathways of target molecules in the nucleus of CyclinD1 and the activity of c-Fos, may be ASMC proliferation signaling networks' molecular switch and the influence mechanism of airway remodeling; shRNA expression vector targeting to inhibit Integrin- beta 1 gene expression, is expected to become an effective means of airway remodeling in asthma gene therapy.

【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R562.25

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