發(fā)布時間：2018-04-13 19:47

  本文選題：哮喘 + ASMC�。� 參考：《暨南大學》2012年博士論文

【摘要】：氣道重塑是支氣管哮喘（簡稱哮喘）的一個重要病理特征，，但其具體發(fā)生機制尚不明確。整合素（Integrin）是一種由α、β亞單位組成的二聚體糖蛋白，能通過獨特的信號傳導途徑調控細胞生長、分化、增殖、凋亡等多個生理過程。現已證實，Integrin-β1廣泛存在于氣道平滑肌細胞（ASMC）表面，并能調控ASMC多個重要的生理過程，故可能對哮喘氣喘重塑有重要影響。本研究通過構建靶向沉默小鼠Integrin-β1的shRNA表達載體，從體外、體內水平探討Integrin-β1在哮喘氣道重塑中的作用及其信號調控機制，從而確定哮喘治療的新靶點。 第一部分整合素-β1對哮喘氣道重塑的影響 目的探討Integrin-β1對哮喘氣道重塑的影響。 方法設計并合成靶向小鼠Integrin-β1基因的shRNA表達載體，分別體外、體內轉入哮喘小鼠模型ASMC，免疫熒光法檢測體內外轉染效率，RT-PCR及Real-time PCR法檢測體外干預前后Integrin-β1mRNA表達變化；Western-blot法檢測體外干預前后Integrin-β1蛋白表達變化；CCK-8法、BrdU ELISA法及流式細胞儀法檢測體外干預前后ASMC增殖率及細胞周期分布時相的變化；Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測體外干預前后ASMC凋亡的變化；Transwell法檢測體外干預前后ASMC遷移率的變化；ELISA法檢測體外干預前后IL-6、IL-8的含量變化；肺組織病理切片觀察體內干預前后哮喘小鼠模型氣道重塑變化。 結果shRNA表達載體能穩(wěn)定轉染哮喘小鼠ASMC，體外轉染后的Integrin-β1的mRNA及其蛋白質水平均顯著下調（P均0.05）；細胞增殖率減低（P0.05），G0/G1期細胞比例增加（P0.05），S期細胞比例降低（P0.05）；細胞凋亡率明顯升高（P0.05）；此外，細胞遷移速率及IL-6、IL-8的含量則顯著降低（P均0.05）；體內轉染后的哮喘小鼠模型的氣道重塑情況有所減輕。 結論Integrin-β1能促使ASMC過度增殖、凋亡減緩、細胞遷移加速、炎癥介質IL-6及IL-8分泌增多，引起氣道平滑肌層增厚，是導致哮喘氣道重塑形成的重要原因。 第二部分整合素-β1在哮喘ASMC增殖信號網絡中的作用及shRNA靶向干預研究 目的探討Integrin-β1對小鼠慢性哮喘模型ASMC增殖信號網絡的調控及shRNA靶向干預作用。 方法構建靶向小鼠Integrin-β1基因的shRNA表達載體，體外轉入哮喘小鼠模型ASMC，免疫熒光法檢測體內外轉染效率，RT-PCR及Real-time PCR法檢測干預前后CyclinD1、c-Fos的mRNA表達變化；Western-blot法檢測干預前后ERK1/2、STAT6、p-ERK1/2、p-STAT6、CyclinD1及c-Fos的蛋白表達變化；CCK-8法、BrdU ELISA法及流式細胞儀法檢測干預前后ASMC增殖率及細胞周期時相分布的變化。 結果shRNA表達載體穩(wěn)定轉染哮喘小鼠ASMC后，CyclinD1和c-Fos的mRNA及其相應蛋白質水平均顯著下調（P均0.05），ERK1/2、STAT6蛋白表達未改變（P均0.05），p-ERK1/2蛋白表達降低（P0.05），而p-STAT6蛋白表達增高（P0.05）；體外轉染后的細胞增殖率顯著減低（P0.05），細胞周期阻滯在G0/G1時相中（P0.05）。 結論哮喘ASMC內Integrin-β1/ERK1/2通路與IL-4/IL-13/STAT6通路間存在交互應答，而Integrin-β1能提高這兩條通路的胞核內靶分子CyclinD1及c-Fos活性，可能是ASMC增殖信號網絡的“分子開關”及影響哮喘氣道重塑的作用機制所在；shRNA表達載體能靶向抑制Integrin-β1基因表達，可望成為哮喘氣道重塑基因治療的有效手段。
[Abstract]:The airway remodeling of bronchial asthma (asthma) is one of the important pathological features, but its pathogenesis is still unclear. Integrin (Integrin) is an alpha, two dimer glycoprotein beta subunit composition, through the unique signal transduction pathways regulating cell growth, differentiation, proliferation, apoptosis and many other the physiological process. It has been confirmed that Integrin- beta 1 exists in airway smooth muscle cells (ASMC) surface, and can regulate the ASMC of a number of important physiological processes, it may have an important impact on asthma asthma remodeling. This study builds the target expression vector to silence shRNA mice Integrin- beta 1 from in vitro, in vivo levels of Integrin- beta 1 in airway remodeling in asthma and its signal regulation mechanism, so as to determine a new target to treat asthma.
The effect of integrin - beta 1 on airway remodeling in asthma
Objective to investigate the effect of Integrin- beta 1 on airway remodeling in asthma.
Methods we designed and synthesized the target expression vector to mouse Integrin- beta 1 gene shRNA respectively in vitro, in vivo into a mouse model of asthma ASMC detection in vivo transfection efficiency of immunofluorescence, expression of Integrin- beta 1mRNA detected before and after the intervention in vitro RT-PCR and Real-time PCR; expression of Integrin- beta 1 protein were detected before and after in vitro Western-blot assay; CCK-8 BrdU method, ELISA method and flow cytometry before and after intervention in vitro detection method ASMC proliferation rate and cell cycle distribution of the phase change; Annexin V-PE/7-AAD double staining changes of ASMC apoptosis assay in vitro before and after intervention; changes of ASMC migration rate before and after intervention by Transwell in vitro; in vitro by ELISA IL-6 detected before and after the intervention, the content of IL-8; changes of airway remodeling in asthmatic mice lung tissue sections were observed before and after intervention.
Results shRNA expression vector can stably transfected asthmatic mice ASMC in vitro after transfection of Integrin- beta 1 and mRNA protein levels were significantly decreased (P < 0.05); reduce the rate of cell proliferation (P0.05), the proportion of cells in G0/G1 phase increased (P0.05), the proportion of cells in S phase decreased (P0.05); the apoptosis rate increased significantly (P0.05); in addition, cell migration rate and IL-6, the content of IL-8 decreased significantly (P < 0.05); airway remodeling in asthmatic mice model in vivo after some relief.
Conclusion Integrin- beta 1 can induce excessive proliferation of ASMC, slow down apoptosis, accelerate cell migration, increase secretion of IL-6 and IL-8 in inflammatory mediators, and cause thickening of airway smooth muscle layer, which is the important cause of airway remodeling in asthma.
The role of the second part integrin beta 1 in the ASMC proliferation signal network of asthma and the study of shRNA targeting intervention
Objective to investigate the effect of Integrin- beta 1 on the regulation of ASMC proliferation signal network and the targeted intervention of shRNA in mice with chronic asthma model.
Methods expression vector to mouse Integrin- beta 1 gene shRNA in vitro to construct target, a mouse model of asthma ASMC detection in vivo transfection efficiency of immunofluorescence, RT-PCR and Real-time were detected before and after intervention by PCR CyclinD1, the expression of c-Fos mRNA detected before and after the intervention of Western-blot; ERK1/2, STAT6, p-ERK1/2, p-STAT6, CyclinD1 and c-Fos expression protein; CCK-8 method, BrdU ELISA method and proliferation rate of ASMC flow cytometry detected before and after the intervention and the distribution of cell cycle changes.
Results shRNA expression vector transfected asthmatic mice after ASMC, CyclinD1 and c-Fos mRNA and their protein levels were significantly lower (P 0.05), ERK1/2, STAT6 protein expression did not change (P < 0.05), lower expression of p-ERK1/2 (P0.05), and the expression of p-STAT6 protein (P0.05); significantly reduce the rate of transfection in vitro after the cell proliferation (P0.05), cell cycle arrest in G0/G1 phase (P0.05).
Conclusion ASMC in asthma exist interactive response Integrin- beta 1/ERK1/2 pathway and IL-4/IL-13/STAT6 pathway, and Integrin- beta 1 can improve the two pathways of target molecules in the nucleus of CyclinD1 and the activity of c-Fos, may be ASMC proliferation signaling networks' molecular switch and the influence mechanism of airway remodeling; shRNA expression vector targeting to inhibit Integrin- beta 1 gene expression, is expected to become an effective means of airway remodeling in asthma gene therapy.

【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R562.25

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本文編號：1745945