本文選題：肺泡液體清除率　切入點(diǎn)：迷走神經(jīng)切斷　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：臨床上多種原因可導(dǎo)致肺泡內(nèi)液體集聚過(guò)多,如:支氣管肺泡灌洗、淹溺、心功能不全、急性肺損傷等。目前已研究證實(shí)肺泡內(nèi)液體清除過(guò)程主要是由肺泡上皮細(xì)胞主動(dòng)重吸收鈉,再由基底側(cè)細(xì)胞膜上鈉鉀ATP酶將其泵入到肺間質(zhì),肺泡內(nèi)的水在滲透壓梯度作用下通過(guò)上皮細(xì)胞膜的水通道或單純擴(kuò)散進(jìn)入肺間質(zhì),最后由淋巴管或毛細(xì)血管回吸收。肺泡液體清除率(alveolar Fluid clearance,AFC)與肺水腫之間關(guān)系密切,提高肺泡液體的清除率,可以加速肺泡內(nèi)積聚的液體的清除,促進(jìn)肺水腫液的回吸收,在此過(guò)程中,肺泡上皮細(xì)胞頂膜上的鈉通道及基底膜上的鈉鉀ATP酶的功能狀態(tài)決定了肺泡上皮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)運(yùn)能力。鈉鉀ATP酶是廣泛存在于膜上的異二聚體跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在肺泡液體清除過(guò)程中,鈉鉀ATP酶的功能是形成細(xì)胞膜內(nèi)外滲透性梯度差,引起鈉離子順濃度差轉(zhuǎn)運(yùn),使3個(gè)鈉離子被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的同時(shí)泵入2個(gè)鉀離子。鈉鉀ATP酶在肺泡上皮細(xì)胞膜上表達(dá)增加或其活性增強(qiáng)能夠促進(jìn)肺泡液體清除。相反,鈉鉀ATP酶在肺泡上皮細(xì)胞膜上低表達(dá)或抑制其活性則導(dǎo)致肺泡液體清除率下降。因此鈉鉀ATP酶的功能是調(diào)節(jié)肺泡上皮功能的一個(gè)重要的和基礎(chǔ)的分子機(jī)制。膽堿能神經(jīng)在肺組織內(nèi)廣泛分布,調(diào)節(jié)著氣道張力、血流供應(yīng)、黏液分泌以及呼吸型式等,膽堿能M型和N型受體在人和鼠類肺泡上皮細(xì)胞上分布,自2000年以來(lái)多項(xiàng)研究采用迷走神經(jīng)切斷或電刺激迷走神經(jīng)方法研究膽堿能神經(jīng)在膿毒癥或非膿毒癥(機(jī)械通氣、缺血再灌注、油酸誘導(dǎo)等)急性肺損傷中的抗炎或抗凋亡作用。最近膜片嵌技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)膽堿能受體激動(dòng)劑卡巴膽堿和oxotremorine能夠劑量依賴性地激活大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞鈉電流,提示膽堿能受體參與調(diào)解了肺泡上皮的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)。臨床上在進(jìn)行支氣管肺泡灌洗操作時(shí),如果應(yīng)用M膽堿能受體阻斷劑阿托品能夠增加肺泡液體回吸收量。推測(cè)膽堿能神經(jīng)可能參與調(diào)節(jié)肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn),但目前對(duì)于膽堿能神經(jīng)在肺泡液體清除中的作用尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外報(bào)道,因此本研究采用了迷走神經(jīng)切斷、電刺激的方法以及外源性給予氯化乙酰膽堿研究了乙酰膽堿在肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用,并進(jìn)一步探討了氯化乙酰膽堿與肺泡上皮鈉鉀ATP酶的相互作用,具體內(nèi)容如下:第一部分迷走神經(jīng)干預(yù)對(duì)小鼠肺泡液體清除作用的影響目的:采用迷走神經(jīng)切斷或電刺激的方法觀察迷走神經(jīng)在肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用,進(jìn)而證明內(nèi)源性乙酰膽堿參與調(diào)解了肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)。方法:60只清潔雄性Balb/c小鼠,體重28-30g,隨機(jī)分為4組,每組15只,其中每組中6只用來(lái)測(cè)量肺泡液體清除率(AFC),6只用來(lái)測(cè)定血漿中乙酰膽堿的水平,3只用來(lái)行HE染色。①假手術(shù)對(duì)照組(Con):左側(cè)迷走神經(jīng)分離,但不處理干預(yù)。②左側(cè)迷走神經(jīng)切斷(LVAG):左側(cè)迷走神經(jīng)分離切斷。③左側(cè)迷走神經(jīng)外周端刺激(LVS1):左側(cè)迷走神經(jīng)分離切斷,電極刺激其外周端,即傳出神經(jīng)。④左側(cè)迷走神經(jīng)中樞端刺激(LVS2):左側(cè)迷走神經(jīng)分離切斷,電極刺激其中樞端,即傳入神經(jīng)。將含有Evans藍(lán)標(biāo)記的5%白蛋白等滲生理鹽水溶液250ul以每2分鐘一次,每次50ul的速度注入小鼠的肺泡腔內(nèi),實(shí)驗(yàn)20分鐘后頸動(dòng)脈放血處死小鼠回吸收肺泡內(nèi)剩余液體,用酶標(biāo)儀測(cè)量Evans藍(lán)標(biāo)記的白蛋白濃度,根據(jù)注入前后白蛋白濃度的變化計(jì)算肺泡液體清除率,以觀察迷走神經(jīng)在肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。因乙酰膽堿在血漿內(nèi)快速被代謝,我們收集迷走神經(jīng)干預(yù)即刻的血漿標(biāo)本,用南京建成的試劑盒測(cè)量血漿乙酰膽堿的含量,從而間接反映迷走神經(jīng)干預(yù)影響了血漿乙酰膽堿水平。HE染色標(biāo)本收集了灌注后30分鐘的組織標(biāo)本,從形態(tài)學(xué)上觀察迷走神經(jīng)干預(yù)對(duì)肺泡液體清除過(guò)程的影響。結(jié)果:與正常對(duì)照組相比,左側(cè)迷走神經(jīng)切斷明顯降低了AFC(66.88±2.64%VS 48.69±2.57%;P0.01);與左側(cè)迷走神經(jīng)切斷組相比,左側(cè)迷走神經(jīng)外周端刺激明顯升高了AFC(48.69±2.57%VS60.81±1.96%;P0.01);而左側(cè)迷走神經(jīng)中樞端刺激出現(xiàn)了更為降低的AFC(38.49±1.45%VS 48.69±2.57%;P0.05)。與對(duì)照組血漿中的乙酰膽堿水平(4.64±0.25ug/ml)相比,左側(cè)迷走神經(jīng)切斷(3.59±0.27ug/ml)及左側(cè)迷走神經(jīng)中樞端刺激(2.98±0.18 ug/ml)血漿中的乙酰膽堿水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而在迷走神經(jīng)外周端刺激組(6.01±0.54 ug/ml)明顯升高,且差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。HE染色結(jié)果顯示對(duì)照組有輕度間質(zhì)水腫;單側(cè)迷走切斷組肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)較多粉紅色灌注液,間質(zhì)水腫明顯;外周端刺激組相對(duì)于單側(cè)迷走切斷組間質(zhì)水腫減輕。結(jié)論：1單側(cè)迷走神經(jīng)切斷降低了AFC,提示迷走神經(jīng)參與調(diào)節(jié)了肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)。2電刺激迷走傳出神經(jīng)而非傳入神經(jīng)能夠逆轉(zhuǎn)降低的AFC,提示迷走神經(jīng)促進(jìn)肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)是通過(guò)其傳出神經(jīng)發(fā)揮作用。3電刺激迷走神經(jīng)外周端明顯升高了血漿乙酰膽堿的水平,提示電刺激迷走神經(jīng)傳出段促進(jìn)肺泡液體清除可能是通過(guò)其末梢釋放內(nèi)源性乙酰膽堿發(fā)揮作用。第二部分氯化乙酰膽堿對(duì)肺泡液體清除率及肺組織鈉鉀ATP酶的影響目的:觀察外源性氯化乙酰膽堿對(duì)肺泡液體清除率及其肺組織勻漿鈉鉀ATP酶的影響方法:昆明小鼠75只,隨機(jī)分為5組,每組15只,其中每組中6只用來(lái)測(cè)量肺泡液體清除率(AFC),6只用來(lái)留取標(biāo)本測(cè)量鈉鉀ATP酶活性及蛋白表達(dá),其余3只留HE染色組織標(biāo)本。①正常對(duì)照(control)。②10-4mol/L乙酰膽堿。③10-5mol/L乙酰膽堿。④10-6mol/L乙酰膽堿。⑤10-6mol/L乙酰膽堿+10-6mol/L阿托品。肺泡腔灌注液為Evans藍(lán)標(biāo)記的5%白蛋白等滲生理鹽水內(nèi)加入上述各組不同濃度的藥物,將灌注液200ul以每次40ul,每2分鐘一次的速度注入昆明小鼠的肺泡內(nèi),20分鐘后用100ul的微量進(jìn)樣器回吸收肺泡內(nèi)殘余液體,用酶標(biāo)儀測(cè)定Evans藍(lán)標(biāo)記的白蛋白濃度,根據(jù)注入前后白蛋白濃度的變化計(jì)算肺泡液體清除率。肺組織灌注液調(diào)整為生理鹽水稀釋的不同濃度的氯化乙酰膽堿,收集肺組織標(biāo)本以用來(lái)測(cè)定鈉鉀ATP酶的活性(南京建成的試劑盒)、膜上Na,K-ATPɑ1蛋白(western blot)表達(dá)及HE染色。結(jié)果:1與對(duì)照組相比,氯化乙酰膽堿劑量依賴性增加了AFC,10-4M氯化乙酰膽堿上調(diào)肺泡液體清除率達(dá)到較高值(42.95±2.41%vs 57.93±3.21%P≤0.01)。10-6M阿托品阻斷了10-6M氯化乙酰膽堿上調(diào)AFC的作用(45.17±1.05%vs 48.99±1.42%P≤0.05)。2對(duì)照組Na,K-ATP酶的活性是3.69±0.19u/mgprot,在氯化乙酰膽堿刺激組其活性分別是10-4M Ach5.85±0.21 u/mgprot;10-5M Ach 5.14±0.22 u/mgprot;10-6M Ach 4.4±0.14 u/mgprot,10-4-10-6M氯化乙酰膽堿明顯增加了Na,K-ATP酶的活性(P0.05),10-6M阿托品阻斷了10-6M氯化乙酰膽堿對(duì)Na,K-ATP酶的作用(3.12±0.42 u/mgprot vs 4.4±0.14 u/mgprot P0.05)。3與正常對(duì)照組相比,乙酰膽堿刺激各組肺組織勻漿Na,K-ATPɑ1蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯差別(P0.05)。結(jié)論：1膽堿能神經(jīng)激動(dòng)劑氯化乙酰膽堿能夠劑量依賴性增加肺泡液體清除率,阿托品能夠阻斷該效應(yīng)。2氯化乙酰膽堿能夠增加肺組織勻漿Na,K-ATP酶的活性,阿托品同樣能夠阻斷該效應(yīng)。3氯化乙酰膽堿刺激對(duì)肺組織勻漿上總Na,K-ATPɑ1的蛋白表達(dá)沒(méi)有影響。第三部分氯化乙酰膽堿對(duì)A549細(xì)胞上Na,K-ATP酶的影響目的:培養(yǎng)肺泡上皮A549細(xì)胞,觀察10-5M氯化乙酰膽堿刺激對(duì)該細(xì)胞膜上Na,K-ATP酶的活性及蛋白表達(dá)量的影響。方法:A549接種至培養(yǎng)皿后,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Con),氯化乙酰膽堿刺激組(10-5mol/L),氯化乙酰膽堿加阿托品阻斷組(10-5mol/L Ach+10-5mol/L Atr),分別觀察5分鐘、10分鐘,并用酶活性測(cè)定試劑盒測(cè)量細(xì)胞上Na,K-ATP酶的活性,采用免疫熒光及western-blot方法觀察細(xì)胞膜上Na,K-ATP酶蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1與對(duì)照組相比,10-5M氯化乙酰膽堿刺激明顯增加了Na,KATPase的活性,5分鐘時(shí)(3.27±0.23 u/mgprot VS 5.34±0.5 u/mgprot P0.01),10分鐘時(shí)(3.22±0.11 u/mgprot VS 3.91±0.22 u/mgprot P0.05)。與氯化乙酰膽堿刺激組相比,加入阿托品阻斷膽堿能M受體后,Na,K-ATPase的活性顯著下降,5分鐘(5.34±0.5 u/mgprot VS 3.62±0.29 u/mgprot P0.01),10分鐘(3.91±0.22 u/mgprot VS 3.27±0.16u/mgprot P0.05)。2免疫熒光結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,10-5M氯化乙酰膽堿刺激5分鐘細(xì)胞膜上Na,K-ATPase蛋白的綠色熒光未見(jiàn)明顯差別,細(xì)胞連接基底側(cè)細(xì)胞膜上可見(jiàn)明顯的熒光積聚,提示用藥組基底側(cè)細(xì)胞膜上出現(xiàn)Na,K-ATPase蛋白積聚。3 western-blot結(jié)果顯示:以對(duì)照組灰度值相比,氯化乙酰膽堿刺激5分鐘明顯增加了基底側(cè)細(xì)胞膜上相對(duì)的Na,K-ATPaseɑ1蛋白含量,與刺激組灰度值相比,膽堿能M受體阻斷劑阿托品阻斷了氯化乙酰膽堿的作用。結(jié)論：1氯化乙酰膽堿能夠增加A549細(xì)胞鈉鉀ATP酶在基底側(cè)細(xì)胞膜上的表達(dá),同時(shí)增強(qiáng)其在膜上的活性。2氯化乙酰膽堿刺激鈉鉀ATP酶在基底側(cè)細(xì)胞膜上的表達(dá)增加及活性增強(qiáng)可被M型膽堿能受體阻斷劑阿托品阻斷,提示氯化乙酰膽堿調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞膜上鈉鉀ATP酶的功能可能是通過(guò)M受體發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1721920