本文選題：肺泡Ⅱ型上皮細胞　切入點：肺泡Ⅰ型上皮細胞　出處：《濱州醫(yī)學院》2015年碩士論文

【摘要】：目的：探討分離、純化、培養(yǎng)原代胎鼠肺泡II型上皮細胞(fAECIIs)的方法；以及維甲酸(RA)與介素24 (IL-24)對fAECIIs增殖及轉(zhuǎn)分化的影響。方法：剖腹取孕19天胎鼠肺組織,運用胰酶、Ⅵ型膠原酶聯(lián)合消化、差速離心、差速貼壁、IgG免疫粘附的方法分離、純化得到fAECIIs。細胞培養(yǎng)24h、48h、72h、96h,倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況；血球細胞計數(shù)板計數(shù)細胞數(shù)目,描繪生長曲線；透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)；免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡觀察肺表面活性蛋白(SP-C)、水通道蛋白5(AQP5)的表達；實時熒光定量PCR (RT-PCR)檢測SP-C mRNA、AQP5 mRNA的表達。利用透射電鏡及激光共聚焦免疫熒光法對細胞進行鑒定。鑒定好的細胞培養(yǎng)24h后,分別以RA、IL-24及IL-24中和抗體(Anti-IL-24)作為干預(yù)方式,干預(yù)作用24、48、72h后,噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖情況和活力,倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況,流式細胞術(shù)檢測細胞周期和細胞凋亡,RT-PCR檢測SP-C mRNA、AQP5 mRNA的表達,Western blot檢測SP-C、AQP5蛋白的表達。結(jié)果：1、分離得到的胎鼠肺泡II型上皮細胞純度為97.8+2.1%。細胞生長狀況：細胞呈島狀分布生長,隨著時間,細胞數(shù)目增多,體積增大,逐漸出現(xiàn)雙核細胞及橋狀連接,最終細胞出現(xiàn)空泡化走向凋亡。細胞數(shù)目：隨時間細胞數(shù)增多,在72h細胞數(shù)最多,之后細胞數(shù)減少,各時間點差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。細胞超微結(jié)構(gòu)：24h、48h細胞有AECII特征性的微絨毛和板層小體；72h細胞處于AECII和肺泡I型上皮細胞(AECI)之間的轉(zhuǎn)分化中間狀態(tài)細胞,細胞表面有微絨毛或細胞質(zhì)內(nèi)有板層小體；96h微絨毛和板層小體消失。免疫熒光：細胞質(zhì)中SP-C綠色熒光在48h表達最強,隨后逐漸減弱,細胞膜上點狀分布的AQP5紅色熒光隨時間逐漸增強,72h可見兩者共表達。SP-C mRNA、AQP5 mRNA的表達：SP-C mRNA在48h表達最強,隨后逐漸減弱；AQP5 mRNA的表達量隨時間逐漸增強。2、RA對fAECIIs的作用：細胞增殖和活力：RA作用24h對細胞增殖和活力無影響(P0.05)；而作用48h后,RA明顯促進細胞增殖、增強細胞活力(P0.01),且促進作用在作用72h最顯著(P0.05)。細胞生長狀況：與對照組相比,RA使得細胞狀態(tài)更佳,細胞貼壁更緊,折光性強,在作用72h效果最明顯。細胞周期：RA作用24h對細胞周期無影響(P0.05),而作用48h、72h后,RA使細胞更多的處于G2期和S期(P0.01)。細胞凋亡：RA作用24h對細胞凋亡無影響(P0.05),而RA作用48h、72h后,早期凋亡與晚期凋亡細胞比例均顯著低于對照組(P0.01)。SP-C mRNA、AQP5mRNA的表達：RA作用24h、72h后,SP-C mRNA的表達顯著高于對照組(P0.01)；RA作用48h后,SP-C mRNA的表達顯著低于對照組(P0.01)。在各時間點,RA均明顯上調(diào)AQP5mRNA的表達(P0.01)。SP-C、AQP5蛋白的表達：RA作用24h、72h后,SP-C蛋白的表達顯著高于對照組(P0.01)；RA作用48h后,SP-C蛋白的表達顯著低于對照組(P0.01)。在各時間點,RA明顯上調(diào)AQP5蛋白的表達(P0.05)。3、IL-24對fAECIIs的作用：差異表達：IL-24mRNA及IL-24蛋白的表達隨時間延長均顯著降低(P0.01)。細胞增殖和活力：IL-24促進細胞增殖(P0.01),促增殖作用在5 μ/gL最顯著;Anti IL-24減慢細胞增殖(P0.01),抑制作用在20 μ g/L就可觀察到。細胞生長狀況：與對照組相比,IL-24使細胞貼壁緊,折光性增強,細胞伸展較少；Anti IL-24使細胞折光性減弱,細胞伸展更明顯。細胞周期：IL-24導致細胞周期的G1減少,S期延長；Anti IL-24導致細胞周期G1期延長,S期明顯減少。細胞凋亡：與對照組相比,IL-24組細胞早期凋亡與晚期凋亡比例顯著降低(P0.01), Anti IL-24組細胞早期凋亡與晚期凋亡比例顯著升高(P0.01)。SP-C mRNA, AQP5 mRNA的表達：IL-24上調(diào)SP-C mRNA的表達,下調(diào)AQP5 mRNA的表達；Anti IL-24上調(diào)AQP5 mRNA的表達,下調(diào)SP-C mRNA的表達。SP-C、AQP5蛋白的表達：IL-24上調(diào)SP-C蛋白的表達,下調(diào)AQP5蛋白的表達;Anti IL-24上調(diào)AQP5蛋白的表達,下調(diào)蛋白SP-C的表達。結(jié)論：1、胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶聯(lián)合消化、差速離心、差速貼壁、IgG免疫粘附方法所得fAECIIs可用于后續(xù)研究；細胞早期(24h-48h)增殖活躍,后期(48h-72h)細胞增殖緩慢,開始轉(zhuǎn)分化,96h后細胞走向凋亡。2、RA通過增強細胞活力、調(diào)節(jié)細胞周期、抑制細胞凋亡促進fAECIIs增殖,并促進SP-C和AQP5的表達,同時它可以促進fAECII向AECI轉(zhuǎn)分化。3、IL-24通過增強細胞活力、調(diào)節(jié)細胞周期、抑制細胞凋亡促進fAECIIs增殖,同時它可以抑制fAECII向AECI轉(zhuǎn)分化。
[Abstract]:Objective : To explore the methods of isolation , purification and culture of alveolar type II epithelial cells ( fAECES ) in primary fetal mice .
The effects of retinoic acid ( RA ) and interleukin - 24 ( IL - 24 ) on the proliferation and differentiation of fAECDC were studied . Methods : The cells were isolated and purified by trypsin and 鈪，

本文編號：1671777