本文選題：肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞　切入點(diǎn)：肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞　出處：《濱州醫(yī)學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：目的：探討分離、純化、培養(yǎng)原代胎鼠肺泡II型上皮細(xì)胞(fAECIIs)的方法；以及維甲酸(RA)與介素24 (IL-24)對(duì)fAECIIs增殖及轉(zhuǎn)分化的影響。方法：剖腹取孕19天胎鼠肺組織,運(yùn)用胰酶、Ⅵ型膠原酶聯(lián)合消化、差速離心、差速貼壁、IgG免疫粘附的方法分離、純化得到fAECIIs。細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h、96h,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況；血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目,描繪生長(zhǎng)曲線；透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡觀察肺表面活性蛋白(SP-C)、水通道蛋白5(AQP5)的表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR)檢測(cè)SP-C mRNA、AQP5 mRNA的表達(dá)。利用透射電鏡及激光共聚焦免疫熒光法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。鑒定好的細(xì)胞培養(yǎng)24h后,分別以RA、IL-24及IL-24中和抗體(Anti-IL-24)作為干預(yù)方式,干預(yù)作用24、48、72h后,噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況和活力,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡,RT-PCR檢測(cè)SP-C mRNA、AQP5 mRNA的表達(dá),Western blot檢測(cè)SP-C、AQP5蛋白的表達(dá)。結(jié)果：1、分離得到的胎鼠肺泡II型上皮細(xì)胞純度為97.8+2.1%。細(xì)胞生長(zhǎng)狀況：細(xì)胞呈島狀分布生長(zhǎng),隨著時(shí)間,細(xì)胞數(shù)目增多,體積增大,逐漸出現(xiàn)雙核細(xì)胞及橋狀連接,最終細(xì)胞出現(xiàn)空泡化走向凋亡。細(xì)胞數(shù)目：隨時(shí)間細(xì)胞數(shù)增多,在72h細(xì)胞數(shù)最多,之后細(xì)胞數(shù)減少,各時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：24h、48h細(xì)胞有AECII特征性的微絨毛和板層小體；72h細(xì)胞處于AECII和肺泡I型上皮細(xì)胞(AECI)之間的轉(zhuǎn)分化中間狀態(tài)細(xì)胞,細(xì)胞表面有微絨毛或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有板層小體；96h微絨毛和板層小體消失。免疫熒光：細(xì)胞質(zhì)中SP-C綠色熒光在48h表達(dá)最強(qiáng),隨后逐漸減弱,細(xì)胞膜上點(diǎn)狀分布的AQP5紅色熒光隨時(shí)間逐漸增強(qiáng),72h可見(jiàn)兩者共表達(dá)。SP-C mRNA、AQP5 mRNA的表達(dá)：SP-C mRNA在48h表達(dá)最強(qiáng),隨后逐漸減弱；AQP5 mRNA的表達(dá)量隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)。2、RA對(duì)fAECIIs的作用：細(xì)胞增殖和活力：RA作用24h對(duì)細(xì)胞增殖和活力無(wú)影響(P0.05)；而作用48h后,RA明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞活力(P0.01),且促進(jìn)作用在作用72h最顯著(P0.05)。細(xì)胞生長(zhǎng)狀況：與對(duì)照組相比,RA使得細(xì)胞狀態(tài)更佳,細(xì)胞貼壁更緊,折光性強(qiáng),在作用72h效果最明顯。細(xì)胞周期：RA作用24h對(duì)細(xì)胞周期無(wú)影響(P0.05),而作用48h、72h后,RA使細(xì)胞更多的處于G2期和S期(P0.01)。細(xì)胞凋亡：RA作用24h對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)影響(P0.05),而RA作用48h、72h后,早期凋亡與晚期凋亡細(xì)胞比例均顯著低于對(duì)照組(P0.01)。SP-C mRNA、AQP5mRNA的表達(dá)：RA作用24h、72h后,SP-C mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P0.01)；RA作用48h后,SP-C mRNA的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P0.01)。在各時(shí)間點(diǎn),RA均明顯上調(diào)AQP5mRNA的表達(dá)(P0.01)。SP-C、AQP5蛋白的表達(dá)：RA作用24h、72h后,SP-C蛋白的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P0.01)；RA作用48h后,SP-C蛋白的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P0.01)。在各時(shí)間點(diǎn),RA明顯上調(diào)AQP5蛋白的表達(dá)(P0.05)。3、IL-24對(duì)fAECIIs的作用：差異表達(dá)：IL-24mRNA及IL-24蛋白的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)均顯著降低(P0.01)。細(xì)胞增殖和活力：IL-24促進(jìn)細(xì)胞增殖(P0.01),促增殖作用在5 μ/gL最顯著;Anti IL-24減慢細(xì)胞增殖(P0.01),抑制作用在20 μ g/L就可觀察到。細(xì)胞生長(zhǎng)狀況：與對(duì)照組相比,IL-24使細(xì)胞貼壁緊,折光性增強(qiáng),細(xì)胞伸展較少；Anti IL-24使細(xì)胞折光性減弱,細(xì)胞伸展更明顯。細(xì)胞周期：IL-24導(dǎo)致細(xì)胞周期的G1減少,S期延長(zhǎng)；Anti IL-24導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期延長(zhǎng),S期明顯減少。細(xì)胞凋亡：與對(duì)照組相比,IL-24組細(xì)胞早期凋亡與晚期凋亡比例顯著降低(P0.01), Anti IL-24組細(xì)胞早期凋亡與晚期凋亡比例顯著升高(P0.01)。SP-C mRNA, AQP5 mRNA的表達(dá)：IL-24上調(diào)SP-C mRNA的表達(dá),下調(diào)AQP5 mRNA的表達(dá)；Anti IL-24上調(diào)AQP5 mRNA的表達(dá),下調(diào)SP-C mRNA的表達(dá)。SP-C、AQP5蛋白的表達(dá)：IL-24上調(diào)SP-C蛋白的表達(dá),下調(diào)AQP5蛋白的表達(dá);Anti IL-24上調(diào)AQP5蛋白的表達(dá),下調(diào)蛋白SP-C的表達(dá)。結(jié)論：1、胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶聯(lián)合消化、差速離心、差速貼壁、IgG免疫粘附方法所得fAECIIs可用于后續(xù)研究；細(xì)胞早期(24h-48h)增殖活躍,后期(48h-72h)細(xì)胞增殖緩慢,開(kāi)始轉(zhuǎn)分化,96h后細(xì)胞走向凋亡。2、RA通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞活力、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)fAECIIs增殖,并促進(jìn)SP-C和AQP5的表達(dá),同時(shí)它可以促進(jìn)fAECII向AECI轉(zhuǎn)分化。3、IL-24通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞活力、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)fAECIIs增殖,同時(shí)它可以抑制fAECII向AECI轉(zhuǎn)分化。
[Abstract]:Objective : To explore the methods of isolation , purification and culture of alveolar type II epithelial cells ( fAECES ) in primary fetal mice .
The effects of retinoic acid ( RA ) and interleukin - 24 ( IL - 24 ) on the proliferation and differentiation of fAECDC were studied . Methods : The cells were isolated and purified by trypsin and 鈪，

本文編號(hào)：1671777