本文選題：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞　切入點(diǎn)：耐多藥結(jié)核　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：背景結(jié)核病(tuberculosis,TB)是由結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的全球范圍內(nèi)的高感染率、高致死率的慢性傳染病。盡管卡介苗(BCG)疫苗普遍應(yīng)用和化療藥物有效性不斷提高,但由于耐藥性等問題的存在,結(jié)核病特別是耐多藥結(jié)核(multiple drug resistant tuberculosis,MDR-TB)仍然嚴(yán)重威脅著人類的健康并給全球帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。MDR-TB是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌至少同時(shí)對異煙肼和利福平耐藥。結(jié)核病的發(fā)病不僅與結(jié)核桿菌的數(shù)量、毒力有關(guān),而且與宿主機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。細(xì)胞免疫(cell mediated immunity,CMI)是調(diào)節(jié)宿主和結(jié)核分枝桿菌相互作用的核心,CD4~+T細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞,可以在不同細(xì)胞因子及環(huán)境因素作用下分化為Th1、Th2、Th17和Treg四種亞群,各細(xì)胞亞群之間可以互相轉(zhuǎn)化,從而使機(jī)體的免疫效應(yīng)和免疫抑制處于精細(xì)而復(fù)雜的平衡狀態(tài)。結(jié)核病患者常存在Thl細(xì)胞免疫功能低下及Thl/Th2免疫應(yīng)答失衡。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的T淋巴細(xì)胞,可通過產(chǎn)生IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子,或依賴于細(xì)胞-細(xì)胞接觸的機(jī)制,抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的活化、增殖及細(xì)胞因子的分泌。在慢性感染中,其關(guān)鍵作用在于調(diào)控病原體誘導(dǎo)的有效T細(xì)胞應(yīng)答與導(dǎo)致嚴(yán)重炎癥及組織破壞的過度T細(xì)胞反應(yīng)之間的平衡,即調(diào)節(jié)抗感染免疫與免疫病理損害之間的平衡�；赥reg細(xì)胞的免疫抑制特性,多種病原體均能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生Treg細(xì)胞,利于病原體免疫逃避從而維持慢性感染。CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞是目前研究較為深入的Treg細(xì)胞,但有關(guān)CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞在MDR-TB患者體內(nèi)的變化的研究鮮有報(bào)道。本研究著眼于Treg細(xì)胞,通過流式細(xì)胞技術(shù)、細(xì)胞共培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)方法,檢測MDR-TB患者外周血Treg細(xì)胞的表達(dá)情況及功能狀態(tài),檢測Treg細(xì)胞的表型改變,從負(fù)性共刺激受體分子介導(dǎo)的信號通路著手,進(jìn)一步分析MDR-TB患者Treg細(xì)胞表達(dá)升高的原因,旨在闡明維持結(jié)核感染中的保護(hù)性免疫和病理損傷之間的平衡的機(jī)制,為臨床免疫輔助治療提供理論依據(jù)。第一部分耐多藥肺結(jié)核患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)方法:選擇20例藥物敏感性肺結(jié)核患者(S-TB組)、18例MDR-TB患者和20例健康對照者(HC組),采用ELISA法檢測外周血主要抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β含量;采用CD4~+CD25~+Foxp3~+、CD4~+CD25~+CD127~-兩種方法標(biāo)記Treg細(xì)胞,流式細(xì)胞技術(shù)觀察外周血Treg細(xì)胞的表達(dá),并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果:MDR-TB患者和S-TB患者外周血IL-10、TGF-β水平顯著高于健康對照者(p0.05),且MDR-TB患者血清IL-10、TGF-β水平高于S-TB組(p0.05);MDR-TB組外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+、CD4~+CD25~+CD127~-T細(xì)胞比例均顯著高于S-TB組(p0.05),且CD4~+CD25~+Foxp3~+T細(xì)胞比例與CD4~+CD25~+CD127~-T細(xì)胞比例呈正相關(guān)(p0.05);MDR-TB組IL-10、TGF-β水平與CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg細(xì)胞比例正相關(guān)。結(jié)論:Treg細(xì)胞至少部分通過產(chǎn)生IL-10、TGF-β發(fā)揮免疫抑制效應(yīng);TB患者免疫功能受損程度與Treg細(xì)胞水平有關(guān),且MDR-TB患者免疫功能損害程度更重;Treg細(xì)胞的持留與MDR-TB的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。第二部分肺結(jié)核患者外周血CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能分析方法:采用免疫磁珠法分離TB患者外周血CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞和CD4~+CD25~-效應(yīng)性T細(xì)胞,采用CFSE法檢測CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞對CD4~+CD25~-效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制功能;去除外周血中CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞,ELISA法測定BCG刺激下PBMCs中細(xì)胞因子IFN-γ的水平。結(jié)果:S-TB、MDR-TB患者外周血淋巴細(xì)胞來源的CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)功能,可有效抑制同源性CD4~+CD25~-效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖,且CD4~+CD25~-T細(xì)胞的增殖反應(yīng)隨CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞數(shù)量增多而降低;去除實(shí)驗(yàn)顯示,去除外周血中CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞后,BCG刺激下S-TB、MDR-TB患者PBMCs中細(xì)胞因子IFN-γ的水平顯著增加,表明TB患者的CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞可有效抑制IFN-γ的生成。結(jié)論:CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞通過抑制Thl細(xì)胞增殖,導(dǎo)致Thl細(xì)胞因子如IFN-γ分泌的減少,從而削弱機(jī)體免疫系統(tǒng)對感染結(jié)核分枝桿菌的清除。第三部分肺結(jié)核患者外周Treg細(xì)胞表面共刺激受體分子CTLA-4、PD-1和ICOS的表達(dá)及與疾病關(guān)系的探討方法:采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測TB患者和正常對照外周血中Treg細(xì)胞表面CTLA-4、PD-1、ICOS分子的表達(dá),比較S-TB患者和MDR-TB患者之間表達(dá)的差異,分析其與Treg比率的相關(guān)性;免疫磁珠法去除TB患者PBMC中的Treg細(xì)胞,應(yīng)用PD-1功能性抗體拮抗PD-1信號通路,檢測分析BCG刺激后PBMC中Treg細(xì)胞的比例。結(jié)果:肺結(jié)核患者外周Treg細(xì)胞CTLA-4、PD-1、ICOS的表達(dá)顯著高于正常對照(p0.05),且CTLA-4、PD-1的上調(diào)在MDR-TB患者較S-TB患者更明顯(p0.05);相關(guān)分析顯示,CTLA-4、PD-1、ICOS表達(dá)與Foxp3的表達(dá)正相關(guān)(p0.05);拮抗PD-1信號通路,可顯著抑制TB患者BCG誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞的活化增殖。結(jié)論:CTLA-4、PD-1、ICOS分子在TB,尤其是MDR-TB中的重要作用,以及對Treg細(xì)胞的調(diào)控,使得對相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)有可能成為未來TB治療的靶標(biāo)�？偨Y(jié)Treg細(xì)胞在結(jié)核患者特別是MDR-TB患者外周血中的表達(dá)明顯升高,且具有有效的免疫抑制功能。細(xì)胞表面負(fù)性共刺激受體分子表達(dá)的改變可能促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖。Treg細(xì)胞通過對機(jī)體免疫力的調(diào)節(jié)而參與MDR-TB的發(fā)生發(fā)展,并影響疾病的轉(zhuǎn)歸與預(yù)后。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R521

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本文編號：1657501