發(fā)布時間：2018-03-08 12:54

  本文選題：Lyn激酶　切入點：人氣道上皮細胞　出處：《西南醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:研究Lyn激酶在白細胞介素-13(IL-13)誘導(dǎo)氣道上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER應(yīng)激)和MUC5AC中的作用機制。方法:1.用人支氣管上皮細胞(16HBE細胞)分別構(gòu)建Lyn高表達細胞株和Lyn低表達細胞株:(1)將我們實驗室已構(gòu)建的Lyn高表達載體通過Lipofectamine 2000,轉(zhuǎn)染到293T細胞中以獲得感染性慢病毒載體顆粒,使用Lyn高表達慢病毒轉(zhuǎn)染16HBE細胞,構(gòu)建Lyn高表達細胞株(Lyn+/+-16HBE細胞株);同時,使用只含有GFP的慢病毒轉(zhuǎn)染16HBE細胞,構(gòu)建對照組細胞株(CTRL-16HBE細胞株)。(2)用Lyn siRNA通過Lipofectamine 2000,轉(zhuǎn)染16HBE細胞構(gòu)建Lyn低表達細胞株(Lyn-siRNA-16HBE細胞株);同時,使用非沉默siRNA轉(zhuǎn)染細胞,構(gòu)建陰性對照細胞株(siCTRL-16HBE細胞株)。2.細胞分組:(1)用IL-13分別刺激Lyn+/+-16HBE細胞和CTRL-16HBE細胞,PBS刺激作為對照。(2)分別用PI-103和4-PBA刺激Lyn-siRNA-16HBE細胞和siCTRL-16HBE細胞,PBS刺激作為對照,之后再加入IL-13或PBS刺激各組細胞。3.檢測方法:(1)Western blot法檢測Lyn、p-Lyn、NFκB p65、p-NFκB p65、Akt1、p-Akt1、PI3K p85α、p-PI3K p85α、CHOP、BiP、組蛋白H3、β-actin蛋白的表達情況。(2)免疫熒光法檢測MUC5AC、BiP、CHOP、NFκB p65,并用SP5 Leica共聚焦顯微鏡(配Leica Application Suite Software軟件)觀察結(jié)果。4.所有統(tǒng)計分析使用spss17.0軟件(chicago,il,usa)進行,并且所有數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差(),使用單因素方差分析來分析多個組間的差異,通過使用tukey-kramer后測試或dunnett'st3分析兩組之間的顯著差異,以p0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1.成功構(gòu)建了lyn+/+-16hbe細胞株、ctrl-16hbe細胞株、lyn-sirna-16hbe細胞株、sictrl-16hbe細胞株。2.在ctrl-16hbe細胞組中,免疫熒光法顯示il-13可誘導(dǎo)增強muc5ac、bip、chop的表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),且westernblot檢測顯示il-13誘導(dǎo)pi3kp85、akt1、nfκbp65相對磷酸化水平明顯升高(p0.05);在il-13誘導(dǎo)lyn+/+-16hbe細胞組與ctrl-16hbe細胞組中,免疫熒光法顯示lyn高表達降低了il-13誘導(dǎo)的muc5ac、bip、chop表達(p0.05),且westernblot顯示lyn+/+-16hbe細胞組比ctrl-16hbe細胞組的pi3kp85、akt1、nfκbp65相對磷酸化水平明顯降低(p0.05)。3.westernblot檢測nfκb在細胞核或細胞質(zhì)中的表達情況顯示,在ctrl-16hbe細胞組中,il-13降低細胞質(zhì)提取物中的nfκbp65水平(p0.05),但il-13增加細胞核提取物中的nfκbp65水平(p0.05);在il-13誘導(dǎo)lyn+/+細胞組與ctrl-16hbe細胞組中,lyn高表達降低細胞核中nfκbp65水平(p0.05)。4.在il-13刺激lyn-sirna-16hbe細胞組和sictrl-16hbe細胞組中,westernblot顯示lyn-sirna-16hbe細胞的pi3kp85、akt1、nfκbp65的相對磷酸化水平明顯升高(p0.05),lyn-sirna-16hbe細胞中bip和chop的蛋白水平高于sictrl細胞,此外加入4-pba可同時降低sictrl-16hbe細胞和lyn-sirna-16hbe細胞bip和chop的表達;免疫熒光法顯示lyn-sirna-16hbe細胞的MUC5AC、BIP、CHOP熒光強度明顯增強(P0.05)。在IL-13刺激的Lyn-siRNA-16HBE細胞組中,免疫熒光法顯示4-PBA或PI-103明顯降低Lyn-siRNA-16HBE細胞MUC5AC、BiP、CHOP的熒光強度(P0.05);另外Western blot顯示,PI-103降低Lyn-siRNA-16HBE細胞的Akt1、NFκB p65磷酸化水平(P0.05),但是PI-103不抑制PI3K p85的磷酸化水平,4-PBA明顯降低Lyn-siRNA-16HBE細胞的p-NFκB p65/NFκB p65水平(P0.05),但是4-PBA不顯著抑制p-PI3K p85/PI3K p85和p-Akt/Akt水平。結(jié)論:1.在Lyn高表達支氣管上皮細胞中,Lyn激酶抑制IL-13誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和MUC5AC,其涉及PI3K p85/Akt/NFκB途徑。2.在Lyn低表達支氣管上皮細胞中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)NFκB的活性,而不是調(diào)節(jié)PI3K p85/Akt的活性。3.在Lyn低表達支氣管上皮細胞中,PI3K p85/Akt通路對IL-13誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和黏液高分泌起著關(guān)鍵作用。4.Lyn激酶通過PI3K p85/Akt/NFκB信號途徑抑制IL-13誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而減輕氣道上皮細胞黏液高分泌。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

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本文編號：1583979