本文選題：N-乙�；�-絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸　切入點：肌成纖維細胞　出處：《河北醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：矽肺是由于在職業(yè)活動中長期吸入二氧化硅(Si O2)粉塵引起,其基本病理特征包括矽結(jié)節(jié)的形成和肺組織纖維化�，F(xiàn)有研究顯示,肺組織局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem,RAS)參與了肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。作為RAS的關(guān)鍵酶,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)含有N端和C端兩個催化結(jié)構(gòu)域。其中C端結(jié)構(gòu)域能夠催化血管緊張素I(angiotensin I,Ang I)轉(zhuǎn)化為血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)。而Ang II是RAS致纖維化效應(yīng)重要的活性蛋白,其作用主要由血管緊張素II的1型受體(angiotensin II type 1 receptor,AT1R)介導,包括誘導炎癥反應(yīng),促進成纖維細胞增殖和細胞外基質(zhì)沉積。ACE N端結(jié)構(gòu)域可特異性水解抗纖維化短肽N-乙酰基-絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,Ac-SDKP),在ACE N端催化結(jié)構(gòu)域缺陷的小鼠體內(nèi)Ac-SDKP含量明顯上調(diào),發(fā)揮抗器官纖維化效應(yīng)。同樣,給予外源性Ac-SDKP,亦能夠降低ACE野生型鼠肺損傷和肺纖維化程度�？梢夾c-SDKP與RAS的交互作用,可能是其抗纖維化作用的重要分子機制之一。在本研究中,以Ang II信號在矽肺纖維化中的作用作為研究的切入點,觀察Ac-SDKP能否通過抑制Ang II的作用調(diào)控矽肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),β2腎上腺素受體-激動型G蛋白(β2 adrenergic receptor-stimulatory G protein,ADRB2-Gs)復合物在矽肺模型中低表達,而在Ac-SDKP抗纖維化治療組中表達顯著上調(diào),提示該蛋白是Ac-SDKP抗矽肺纖維化中的調(diào)控蛋白之一。ADRB2抗器官纖維化作用與其促進環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的合成有關(guān)。相關(guān)研究報道,c AMP信號和Ang II/轉(zhuǎn)化生長因子(transforming gorwth factor-β1,TGF-β1)信號的交互作用在纖維化的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。c AMP信號能夠抑制Ang II/TGF-β1誘導的成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化及膠原合成。Ang II/TGF-β1則能夠通過上調(diào)磷酸二脂酶(phosphodiesterase,PDE)加速c AMP的水解。而Ac-SDKP對c AMP信號和Ang II信號的調(diào)控及Ac-SDKP能否通過c AMP信號調(diào)節(jié)Ang II信號,目前文獻報道較少。綜合以上研究,本實驗通過構(gòu)建矽肺動物模型結(jié)合Ang II誘導的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化模型,觀察Ac-SDKP與Ang II信號和c AMP信號的交互作用對矽肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響,并分析Ac-SDKP能否通過活化c AMP,促進c AMP依賴性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信號及其下游的c AMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(c AMP-response element binding protein,CREB),從而發(fā)揮抗矽肺纖維化的作用。以進一步揭示矽肺發(fā)生、發(fā)展及Ac-SDKP保護效應(yīng)的可能機制。第一部分Ac-SDKP、Ang II信號和c AMP信號的動態(tài)變化對矽肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響目的:通過建立矽肺動物模型,并體外觀察Ang II誘導大鼠成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的效應(yīng),分析Ac-SDKP、ACE/Ang II/AT1R軸和c AMP信號的變化對矽肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響。方法:1采用HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建大鼠矽肺模型。染塵參數(shù):染毒室容積0.3m3,柜內(nèi)溫度20~25℃,濕度70%~75%,壓力-50Pa~+50Pa,氧氣濃度20%,Si O2粉塵進入速度為3.0~3.5ml/min,柜內(nèi)粉塵質(zhì)量濃度2000 mg/m3,每只動物每天染塵3h。3周齡雄性Wistar大鼠隨機分為6組,每組10只。分別染塵0周、2周、4周、8周、12周、16周,觀察大鼠矽肺形成的動態(tài)變化。2觀察Ang II(10-7mol/L)誘導不同時間點(0、5min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h)大鼠肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的效應(yīng)。3采用HE染色、Masson染色法觀察肺組織病理形態(tài)的改變,分別采用免疫組織化學法、Western blot法檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型膠原、纖連蛋白(fibronectin,Fn)、波形蛋白(Vimentin)、Gαs、抑制型G蛋白(inhibitory G protein,Gαi2/3)、ACE及AT1R的蛋白表達及定位。采用酶免疫分析法(EIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)檢測Ac-SDKP、Ang II和c AMP的含量。結(jié)果:1 HE染色結(jié)果顯示,對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰、肺泡壁薄,無明顯炎細胞浸潤。染塵2周后,可見肺泡壁增寬并伴有巨噬細胞浸潤。矽肺模型4周組偶見孤立的細胞性結(jié)節(jié)形成(主要由巨噬細胞構(gòu)成)。矽肺模型8周、12周組大鼠肺組織肺泡間隔增寬明顯,且細胞性結(jié)節(jié)數(shù)量增多。矽肺模型16周組肺組織內(nèi)可見多個細胞性結(jié)節(jié)的融合和間質(zhì)纖維化的形成,并可見細胞纖維性矽結(jié)節(jié)的形成。Masson染色顯示結(jié)節(jié)及間質(zhì)纖維化區(qū)域出現(xiàn)藍紫色膠原沉積,并隨模型制備時間的延長逐漸增加,至矽肺模型16周組最為顯著。2免疫組織化學染色顯示,在矽肺模型16周組,α-SMA標記的肌成纖維細胞主要位于細胞性結(jié)節(jié)周邊及間質(zhì)纖維化病變區(qū)域。Vimentin陽性表達于細胞性結(jié)節(jié)區(qū)域。Western blot結(jié)果顯示,α-SMA、I型膠原、Fn、Vimentin的蛋白表達在矽肺模型4周、8周、12周、16周較對照組逐漸增多。3 Western blot及ELISA結(jié)果顯示,與對照組相比在矽肺模型2周、4周、8周、12周、16周組,ACE、Ang II、AT1R的含量逐漸升高。肺組織Ac-SDKP的水平在矽肺模型2周組較對照組明顯升高,隨后在矽肺模型組4周、8周、12周、16周組含量逐漸降低。4 Western blot結(jié)果顯示,Gαi2/3的蛋白表達在矽肺模型4周、8周、12周、16周組與對照組比較逐漸增多。在矽肺模型8周組Gαs的蛋白表達及c AMP的含量較對照組開始出現(xiàn)明顯降低,至染塵16周達最低。5 Ang II能夠誘導肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化。α-SMA、I型膠原、Fn的蛋白表達隨誘導時間的延長逐漸升高。Gαs、c AMP的表達隨Ang II刺激時間的延長逐漸降低,而Gαi2/3的蛋白表達逐漸升高。第二部分Ac-SDKP活化c AMP/PKA信號抑制矽肺纖維化的作用及機制目的:分別給予矽肺大鼠Ac-SDKP和cAMP類似物db-cAMP抗纖維化治療及預防治療。體外采用Ang II誘導大鼠肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化,并給予Ac-SDKP、db-c AMP及選擇性PKA阻斷劑H89的預處理,觀察c AMP/PKA信號活化在Ac-SDKP抑制矽肺纖維化中的作用。方法:1采用HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建大鼠矽肺動物模型,將動物隨機分組:1)對照16周組;2)矽肺模型16周組;3)Ac-SDKP抗纖維化治療組;4)Ac-SDKP預防治療組;5)db-c AMP抗纖維化治療組;6)db-c AMP預防治療組。2原代培養(yǎng)大鼠肺成纖維細胞,實驗分組為:1)正常對照組;2)Ang II(10-7mol/L)誘導組;3)Ang II+Ac-SDKP(10-8mol/L)組;4)Ang II+Ac-SDKP+H89(10-6mol/L)組;5)Ang II+db-c AMP(10-4mol/L)組;6)Ang II+db-c AMP+H89組。3采用Western blot、ELSIA法檢測體內(nèi)外α-SMA、I型膠原、Vimentin、Fn、ACE、Ang II、AT1R、Gαs、Gαi2/3、c AMP和PKA的蛋白表達。采用免疫熒光化學染色檢測矽肺組織α-SMA/Gαi3及成纖維細胞α-SMA/PKA的共表達。結(jié)果:1 Western blot結(jié)果顯示,與矽肺模型16周組比較,Ac-SDKP及db-c AMP抗纖維化治療組和預防治療組α-SMA、I型膠原、Fn和Vimentin的蛋白表達明顯下調(diào)。2 Western blot結(jié)果顯示,Ac-SDKP、db-c AMP抗纖維化治療組和預防治療組,AT1R的蛋白表達較矽肺模型16周組明顯降低,ACE和Ang II的表達在Ac-SDKP和db-c AMP治療組下降,但差異無統(tǒng)計學意義。3免疫熒光化學染色顯示,在矽肺模型16周組,纖維化病變區(qū)域有大量綠色熒光標記的α-SMA陽性表達。Gαi3紅色熒光的表達亦顯著增加,采用兩種蛋白熒光組合定位技術(shù),可見α-SMA和Gαi3共表達于矽結(jié)節(jié)及間質(zhì)纖維化區(qū)域。Ac-SDKP、db-c AMP抗纖維化治療組和預防治療組,Gαi3與α-SMA的陽性表達降低。Western blot結(jié)果顯示,與矽肺模型16周組相比,在Ac-SDKP、db-c AMP治療組,Gαi2/3蛋白表達下降,Gαs、c AMP、PKA蛋白表達明顯上調(diào)。4免疫組織化學染色顯示,經(jīng)Ang II誘導24h后,與對照組相比,胞漿內(nèi)有大量α-SMA陽性表達。給予Ac-SDKP和db-c AMP干預后,α-SMA陽表達明顯減弱。而H89能夠顯著抑制Ac-SDKP和db-c AMP作用。Western blot結(jié)果顯示,Ac-SDKP、db-c AMP干預能明顯下調(diào)Ang II誘導的α-SMA、I型膠原和Fn的蛋白表達。Ac-SDKP+H89、db-c AMP+H89干預組α-SMA、I型膠原、Fn的蛋白表達明顯上調(diào)。5 Western blot結(jié)果顯示,給以Ac-SDKP、db-c AMP預處理,Gαi2/3蛋白的表達均較Ang II誘導組下調(diào),Gαs的蛋白表達較Ang II誘導組上調(diào)。Ac-SDKP+H89、db-c AMP+H89干預組Gαi2/3蛋白表達明顯升高,Gαs蛋白的表達明顯降低。6免疫熒光染色檢測α-SMA/PKA共表達結(jié)果顯示,對照組PKA蛋白陽性表達于細胞漿及細胞核中,胞漿中α-SMA纖維狀結(jié)構(gòu)呈微弱表達或無表達。經(jīng)Ang II誘導24h后,與對照組相比,PKA蛋白陽性表達減弱,α-SMA陽性表達則明顯增強。給予Ac-SDKP和db-c AMP干預后,與Ang II組相比,PKA陽性表達明顯增強,α-SMA陽性表達明顯降低。而H89阻斷了Ac-SDKP和db-c AMP的作用。Western blot結(jié)果顯示,予以Ac-SDKP、db-c AMP干預后,與Ang II組比較,c AMP、PKA蛋白表達明顯上調(diào)。Ac-SDKP+H89、db-c AMP+H89干預組c AMP、PKA蛋白表達下降。第三部分Ac-SDKP調(diào)節(jié)p CREB、p Smad2/3信號抑制矽肺纖維化的作用及機制目的:采用矽肺動物模型及體外細胞培養(yǎng),觀察Ac-SDKP抑制矽肺纖維化的作用是否與調(diào)控p CREB、p Smad2/3信號有關(guān)。方法:1采用HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建大鼠矽肺模型,動物被隨機分為:1)對照16周組;2)矽肺模型16周組;3)Ac-SDKP抗纖維化治療組;4)Ac-SDKP預防治療組;5)db-c AMP抗纖維化治療組;6)db-c AMP預防治療組。2大鼠肺成纖維細胞分別給予以下處理:1)正常對照組;2)Ang II(10-7mol/L)誘導組;3)Ang II+Ac-SDKP(10-8mol/L)組;4)Ang II+Ac-SDKP+H89(10-6mol/L)組;5)Ang II+db-c AMP(10-4mol/L)組;6)Ang II+db-c AMP+H89組。3采用Western blot檢測矽肺組織及成纖維細胞中p CREB、CREB、p Smad2/3和Smad2/3的蛋白表達。免疫熒光染色法檢測體內(nèi)外p CREB/α-SMA、p Smad2/3與α-SMA的共表達,應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)觀察成纖維細胞核中p CREB、p Smad2/3與CREB結(jié)合蛋白(CREB binding protein,CBP)的相互作用。結(jié)果:1免疫組織化學染色結(jié)果顯示,p CREB在肺泡上皮細胞中陽性表達較為顯著,在矽結(jié)節(jié)內(nèi)陽性表達減弱。而p Smad2/3在矽結(jié)節(jié)內(nèi)陽性表達顯著升高。免疫熒光化學染色顯示,在正常對照組中,可見紅色熒光標記的p Smad2/3蛋白微弱表達于細胞核中,α-SMA蛋白綠色熒光主要表達于氣管平滑肌細胞。矽肺模型16周組,α-SMA蛋白主要表達于矽結(jié)節(jié)周圍及肺泡壁增寬區(qū)域,p Smad2/3蛋白亦在上述部位的細胞核中表達明顯增多,將兩種熒光標記的蛋白圖像組合后發(fā)現(xiàn),纖維化病變區(qū)域的一些細胞胞漿內(nèi)既有α-SMA蛋白陽性表達,又有細胞核中p Smad2/3蛋白的陽性表達。在Ac-SDKP及db-c AMP抗纖維化治療和預防治療組中,p Smad2/3蛋白和α-SMA蛋白陽性表達減弱。Western blot結(jié)果顯示,在矽肺模型16周組p CREB蛋白表達下調(diào),p Smad2/3蛋白表達明顯上調(diào)。Ac-SDKP、db-c AMP治療組,促進了p CREB蛋白表達,抑制了p Smad2/3蛋白表達。CREB、Smad2/3的蛋白表達無明顯差異。2免疫熒光染色觀察α-SMA/p CREB的共定位表達結(jié)果顯示,在對照組,p CREB較多表達于細胞核,胞漿中亦有表達,而α-SMA呈微弱表達或無表達。經(jīng)Ang II誘導24h后,細胞中p CREB陽性表達顯著下降,α-SMA陽性表達則明顯增強。分別給予Ac-SDKP和db-c AMP干預后,細胞中α-SMA表達明顯減弱,p CREB陽性表達明顯增強。H89能夠顯著抑制Ac-SDKP和db-c AMP的作用。免疫熒光染色結(jié)果還顯示,Ang II能夠顯著增強細胞核中p Smad2/3表達及細胞漿中α-SMA的表達。Ac-SDKP及db-c AMP預處理,降低了成纖維細胞中p Smad2/3和α-SMA的共表達。H89能夠顯著阻斷Ac-SDKP和db-c AMP的作用。Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)Ang II誘導24h后,成纖維細胞p CREB的表達降低,p Smad2/3蛋白的表達顯著增強。Ac-SDKP、db-c AMP預處理后明顯促進了p CREB的表達,降低了p Smad2/3的蛋白表達。H89預處理取消了Ac-SDKP、db-c AMP的上述作用。CREB、Smad2/3的蛋白表達無明顯差異。3成纖維細胞免疫共沉淀結(jié)果顯示,CBP能夠分別與p Smad2/3和p CREB結(jié)合。在Ang II誘導組,p Smad2/3與CBP的結(jié)合上調(diào),而p CREB與CBP的結(jié)合降低。給予Ac-SDKP、db-c AMP預處理,促進了p CREB與CBP的結(jié)合,降低了p Smad2/3與CBP的結(jié)合。結(jié)論:1矽肺組織局部ACE/Ang II/AT1R在矽肺發(fā)生、發(fā)展過程中逐漸升高,并且體外Ang II能夠刺激肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化;Ac-SDKP、c AMP的表達在矽肺發(fā)生、發(fā)展過程中呈下降趨勢。Ac-SDKP與c AMP信號和Ang II信號參與了大鼠矽肺纖維化過程。2在矽肺組織及Ang II誘導的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化中,Ac-SDKP可通過活化c AMP/PKA/p CREB信號抑制p Smad2/3的表達,且Ac-SDKP可促進p CREB/CBP復合物的形成,降低p Smad2/3與CBP的結(jié)合,抑制Smad信號,發(fā)揮其抗矽肺纖維化的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R135.2

【參考文獻】

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本文編號：1583634