本文選題：RNA干擾　切入點(diǎn)：慢病毒載體　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》2016年09期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的:構(gòu)建轉(zhuǎn)化生長因子β型受體Ⅰ(transforming growth factor beta receptorⅠ,TGFβRⅠ)基因RNA干擾(RNA interference,RNAi)慢病毒載體并在人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC-5上鑒定其沉默效應(yīng)。方法:構(gòu)建4種針對人TGFβRⅠ基因不同干擾靶點(diǎn)的慢病毒干擾載體,PCR篩選陽性克隆,測序鑒定,將篩選出的4種有效重組慢病毒干擾載體和其它輔助質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并測定病毒滴度。最后將4種重組的慢病毒干擾載體分別感染MRC-5細(xì)胞,采用Real-time PCR和Western blot檢測它們對靶基因的沉默效率。結(jié)果:經(jīng)雙酶切鑒定和DNA測序,證實(shí)短發(fā)夾RNA正確插入慢病毒載體且插入的序列正確。4種重組慢病毒干擾載體經(jīng)293T細(xì)胞成功包裝后,其病毒滴度分別為:si RNA-1 6.37×107 TU/ml、si RNA-2 1.65×108 TU/ml、si RNA-3 4.50×108TU/ml、si RNA-4 2.31×108TU/ml,陰性對照組載體包裝后的病毒滴度為:1.79×109 TU/ml。4種重組慢病毒干擾載體感染MRC-5細(xì)胞的效率均為93%左右。與正常對照組和陰性對照組比較,在感染4種重組慢病毒干擾載體(si RNA-1~4)后,MRC-5細(xì)胞內(nèi)TGFβRⅠm RNA表達(dá)水平均明顯下降(P=0.000),其中TGFβRⅠ-si RNA-2下降最明顯,沉默效率最好。Western blot結(jié)果與q RT-PCR結(jié)果一致,4種重組慢病毒干擾載體均能使MRC-5細(xì)胞內(nèi)TGFβRⅠ蛋白表達(dá)明顯下降(P=0.000),且TGFβRⅠ-si RNA-2干擾效率最大。結(jié)論:篩選并構(gòu)建了能有效沉默TGFβRⅠ基因的最佳RNAi重組慢病毒載體——TGFβR-si RNA-2,從而為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: to construct the lentivirus vector of transforming growth factor beta receptor 鈪，

本文編號：1571662