本文關(guān)鍵詞： 銅綠假單胞菌 氣道重塑 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1) 金屬蛋白酶(MMP) 銅綠假單胞菌 氣道重塑 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) 整合素αvβ6 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1) 金屬蛋白酶(MMP)　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)是臨床常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病菌,具有復(fù)雜的耐藥機(jī)制,可引起嚴(yán)重的下呼吸道感染。近年來(lái),由于泛耐藥菌株的流行,銅綠假單胞菌下呼吸道感染患者常出現(xiàn)抗感染療程延長(zhǎng),遷延不愈,甚至導(dǎo)致患者病死率增加。反復(fù)感染與氣道上皮的纖維化修復(fù)密切相關(guān),后者可引起患者不可逆的肺功能下降及遠(yuǎn)期不良預(yù)后,因此,如何改善氣道纖維化重塑,對(duì)于銅綠假單胞菌下呼吸道感染的患者具有重要的臨床意義。上皮細(xì)胞可經(jīng)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)分化為纖維化病灶中的成纖維細(xì)胞,活化的成纖維細(xì)胞可繼續(xù)分化為肌成纖維細(xì)胞,并分泌過(guò)多基質(zhì)金屬蛋白酶來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)纖維化進(jìn)程,因此,EMT是纖維化病灶中成纖維細(xì)胞的重要來(lái)源之一。我們假設(shè),支氣管上皮細(xì)胞在銅綠假單胞菌感染時(shí)可能發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化,從而引起氣道纖維化重塑。整合素αvβ6是特異性表達(dá)于上皮細(xì)胞的細(xì)胞粘附分子,可以通過(guò)改變轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)前體構(gòu)象,可控地上調(diào)局部TGF-β1活性。研究發(fā)現(xiàn)整合素αvβ6可調(diào)控肺、腎纖維化及相關(guān)上皮細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化,這與其上調(diào)局部TGF-β1-Smad2/3信號(hào)通路相關(guān),后者是纖維化的主要機(jī)制之一,因此我們猜想,整合素αvβ6可能通過(guò)調(diào)控TGF-β1-Smad2/3信號(hào)通路來(lái)參與銅綠假單胞菌相關(guān)的氣道纖維化重塑過(guò)程,而其中和性抗體可能抑制銅綠假單胞菌相關(guān)的支氣管上皮細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化,從而改善氣道纖維化重塑。本課題分為兩部分:1.以銅綠假單胞菌LPS作為干預(yù)手段,支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,驗(yàn)證EMT是否參與銅綠假單胞菌相關(guān)的氣道纖維化,并探究其相關(guān)信號(hào)通路;2.以整合素αvβ6中和性抗體為治療藥物,探討整合素ααvβ6在BEAS-2B細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用及其機(jī)制,明確其中和性抗體對(duì)此病理過(guò)程的治療作用,為改善銅綠假單胞菌感染相關(guān)的氣道纖維化重塑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一部分銅綠假單胞菌LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞EMT研究研究目的驗(yàn)證EMT是否參與銅綠假單胞菌相關(guān)的氣道纖維化重塑,并探究其相關(guān)信號(hào)通路。研究方法(1)以銅綠假單胞菌LPS(Lipolysyccharide,LPS)2μg/ml誘導(dǎo)人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞,建立體外EMT病理模型。按LPS作用時(shí)間不同,將人正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞分為:空白對(duì)照組(Con)、LPS作用24小時(shí)組、LPS作用48小時(shí)組、LPS作用72小時(shí)組,應(yīng)用Western blot以及間接細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)上皮標(biāo)記蛋白E-鈣黏素(E-cadherin,E-Cad)、間質(zhì)標(biāo)記物波形蛋白(vimentin,Vi)表達(dá);倒置顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;(2)Western blot檢測(cè)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)表達(dá)水平;(3)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MMP-2和MMP-9分泌濃度;(4)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TGF-β1水平,Western blot 檢測(cè) Smad2/3(T-Smad2/3)以及磷酸化 Smad2/3(p-Smad2/3)的表達(dá)水平;研究結(jié)果(1)銅綠假單胞菌LPS可誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化:以銅綠假單胞菌LPS2μμg/ml分別作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后,Western blot顯示,與空白對(duì)照組比較,隨LPS作用時(shí)間延長(zhǎng),BEAS-2B細(xì)胞上皮標(biāo)記蛋白E-Cad表達(dá)顯著下調(diào)(p0.05),而間質(zhì)標(biāo)記物Vi表達(dá)顯著增加(p0.05);間接細(xì)胞免疫熒光亦提示,與空白對(duì)照組比較,隨LPS作用時(shí)間延長(zhǎng),BEAS-2B細(xì)胞上皮標(biāo)記蛋白E-Cad表達(dá)逐漸下降,而間質(zhì)標(biāo)記物Vi表達(dá)逐漸增加;倒置顯微鏡觀察顯示,與空白對(duì)照組比較,LPS作用72小時(shí)組細(xì)胞形態(tài)由類鵝卵石樣上皮表型變?yōu)樗笮伍g質(zhì)樣外觀;(2)Western blot結(jié)果提示,與空白對(duì)照組比較,LPS作用72小時(shí)后,肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA表達(dá)顯著上調(diào)(p0.05);(3)ELISA提示,與空白對(duì)照組相比較,LPS作用72小時(shí)后,細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MMP-2和MMP-9濃度顯著升高(p0.05);(4)Westernblot提示,與空白對(duì)照組比較,LPS作用72小時(shí)后,BEAS-2B細(xì)胞Smad2/3磷酸化水平升高(p0.05);ELISA提示,與空白對(duì)照組比較,LPS作用72小時(shí)后,細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TGF-β1濃度顯著升高(p0.05),TGF-β1-Smad2/3信號(hào)通路激活。結(jié)論(1)銅綠假單胞菌LPS可以誘導(dǎo)人支氣管細(xì)胞BEAS-2B發(fā)生EMT;(2)伴隨EMT過(guò)程,BEAS-2B細(xì)胞可過(guò)度分泌MMP-2和MMP-9,且能進(jìn)一步分化為肌成纖維細(xì)胞;(3)TGF-β1-Smad2/3信號(hào)通路的激活是銅綠假單胞菌LPS誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞EMT的潛在機(jī)制。第二部分 整合素αvβ6對(duì)銅綠假單胞菌LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞EMT的調(diào)控作用及其機(jī)制研究目的探討整合素αvβ6在BEAS-2B細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用及其機(jī)制,明確整合素αvβ6中和性抗體對(duì)BEAS-2B細(xì)胞EMT及其相關(guān)生物學(xué)行為的治療作用,為改善銅綠假單胞菌感染相關(guān)的氣道纖維化重塑提供干預(yù)選擇。研究方法(1)銅綠假單胞菌LPS 2μg/ml作用BEAS-2B細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí),Western blot檢測(cè)整合素αvβ6表達(dá);(2)將人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B分為以下幾組:空白對(duì)照組、LPS組、LPS+整合素αvβ6中和性抗體10D5組、LPS+TGF-β1受體特異性拮抗劑SB431542組、整合素αvβ6中和性抗體10D5組,Western blot以及間接細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)上皮標(biāo)記蛋白E-Cad、間質(zhì)標(biāo)記物Vi;倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;(3)Western blot檢測(cè)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA表達(dá)水平;ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2和MMP-9分泌濃度;(4)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1分泌水平,Western blot檢測(cè)T-Smad2/3以及p-Smad2/3的表達(dá)水平;研究結(jié)果(1)Western blot顯示,伴隨EMT過(guò)程,銅綠假單胞菌LPS可誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞整合素αvβ6表達(dá)顯著上調(diào)(p0.05);(2)Western blot檢測(cè)E-Cad和Vi蛋白表達(dá),與空白對(duì)照組對(duì)比,LPS組BEAS-2B細(xì)胞上皮標(biāo)記蛋白E-Cad表達(dá)顯著下調(diào)(p0.05),而間質(zhì)標(biāo)記物Vi表達(dá)顯著增加(p0.05);整合素αvβ6中和性抗體10D5及TGF-β1受體特異性拮抗劑SB431542治療組可逆轉(zhuǎn)EMT標(biāo)記蛋白E-Cad及Vi的表達(dá)變化(p0.05);間接細(xì)胞免疫熒光提示,與空白對(duì)照組對(duì)比,銅綠假單胞菌LPS可導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞E-Cad表達(dá)下降,而間質(zhì)標(biāo)記物Vi表達(dá)增加,整合素αvβ6中和性抗體10D5及TGF-β1受體特異性拮抗劑SB431542治療組可逆轉(zhuǎn)此變化;倒置顯微鏡觀察顯示,伴隨EMT過(guò)程,BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)由鵝卵石樣上皮細(xì)胞外觀形變?yōu)樗笮伍g質(zhì)樣,整合素αvβ6中和性抗體10D5及TGF-β1受體特異性拮抗劑SB431542治療可改善此變化;(3)Western blot提示,與空白對(duì)照組對(duì)比,銅綠假單胞菌LPS可誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞α-SMA表達(dá)顯著上調(diào)(p0.05),整合素αvβ6中和性抗體10D5及SB431542治療組可逆轉(zhuǎn)α-SMA的上調(diào)(p0.05);ELISA提示,與空白對(duì)照組相比,銅綠假單胞菌LPS可引起B(yǎng)EAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MMP-2和MMP-9濃度顯著升高(p0.05),整合素αvβ6中和性抗體10D5及TGF-β1受體特異性拮抗劑SB431542治療組可改善MMP-2和MMP-9的過(guò)度分泌(p0.05);(4)Western blot提示,銅綠假單胞菌LPS可導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞Smad2/3磷酸化水平升高(p0.05),整合素αvβ6中和性抗體10D5及TGF-β1受體特異性拮抗劑SB431542治療組可改善此變化(p0.05);ELISA提示,銅綠假單胞菌LPS作用組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TGF-β1分泌濃度顯著升高(p0.05),整合素αvβ6中和性抗體10D5治療組可逆轉(zhuǎn)活化TGF-β1的過(guò)度分泌(p0.05),而TGF-p1受體特異性拮抗劑SB431542不影響TGF-β1的分泌水平。結(jié)論(1)銅綠假單胞菌LPS誘導(dǎo)人支氣管細(xì)胞BEAS-2B發(fā)生EMT的同時(shí)顯著上調(diào)整合素αvβ6表達(dá);(2)整合素αvβ6中和性抗體可抑制銅綠假單胞菌LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞EMT,抑制其進(jìn)一步分化為肌成纖維細(xì)胞,改善MMP-2和MMP-9過(guò)度分泌;(3)整合素αvβ6通過(guò)激活TGF-β1-Smad2/3信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)銅綠假單胞菌LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化,因此可作為治療銅綠假單胞菌感染相關(guān)氣道纖維化重塑的干預(yù)靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R56

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