本文關(guān)鍵詞： 人抗原R 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 鋅指E盒結(jié)合蛋白1 香煙煙霧提取物　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種在世界范圍內(nèi)都有頗高發(fā)病率、病死率的呼吸道疾患。2017年更新的慢性阻塞性肺疾病全球倡議(GOLD)指南中指出,C0PD是一種由有毒的顆�；驓怏w損傷氣道及肺組織而引起的疾病,不再單獨提及慢性炎癥反應(yīng)這一因素。在發(fā)病機制描述方面,指南除肯定了氧化應(yīng)激、蛋白酶破壞、炎癥反應(yīng)等先前的共識外,非炎癥機制對C0PD發(fā)病的重要性得到人們的日益關(guān)注。非炎癥機制包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)活化、Wrt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常和E-鈣粘蛋白流失等,以上機制同時與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生密切相關(guān)。EMT是指上皮細胞經(jīng)過一系列變化后最終轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂虚g質(zhì)細胞特點細胞的過程。研究表明,EMT與組織纖維化、組織重塑、腫瘤發(fā)生以及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等病理改變有關(guān)。有證據(jù)顯示,EMT與包括C0PD在內(nèi)的多種纖維化肺疾病存在密切關(guān)系。EMT作為COPD發(fā)病的潛在機制,在氣道重塑、纖維化甚至惡變中都發(fā)揮了作用,具有重要的研究價值。EMT的調(diào)控涉及諸多信號通路、轉(zhuǎn)錄因子,共同構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),臨床藥物研究多針對單一途徑,很難達到調(diào)控目的。人抗原R(human antigen R,HuR)是一種廣為研究的RNA結(jié)合蛋白,可以與多種蛋白的信使RNA(mRNA)結(jié)合,并通過影響其穩(wěn)定性或者翻譯過程發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。研究表明,HuR參與了多種EMT相關(guān)細胞因子的調(diào)控,但是在COPD中,HuR是否參了與EMT的調(diào)控以及能否通過調(diào)控HuR來影響EMT進程目前尚無有關(guān)報導(dǎo)。目的:本文旨在明確HuR在C0PD患者氣道上皮中的表達水平,以及在香煙煙霧提取物(CSE)刺激的氣道上皮BEAS-2B中的表達及活性情況,在細胞水平探討HuR對EMT的調(diào)控作用。方法:免疫組織化學(xué)法檢測人肺臟組織氣道上皮中HuR的表達情況,并量化分析與患者一秒用力呼氣容積(FEV1)的相關(guān)性,實驗分為對照不吸煙組、對照吸煙組、C0PD吸煙組;實驗室培養(yǎng)人氣道上皮細胞株(BEAS-2B),采用香煙煙霧提取物(CSE)刺激方式模擬C0PD致病狀態(tài),蛋白印跡法檢測不同CSE刺激條件下HuR表達水平;蛋白印跡法、免疫熒光法檢測HuR活性,根據(jù)CSE刺激時間,實驗分為對照組、3小時組、6小時組和9小時組;采用小RNA干擾技術(shù)抑制HuR表達,分別應(yīng)用定量實時熒光PCR及蛋白印跡法檢測抑制表達效率;CSE刺激BEAS-2B及干擾HuR表達后,蛋白印跡法、免疫熒光法檢測E-鈣粘蛋白、波形蛋白表達情況,應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察BEAS-2B細胞形態(tài)變化,實驗主要分為對照組、CSE組和CSE+HuR干擾組;干擾HuR表達后,檢測EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子鋅指E盒結(jié)合蛋白1(ZEB-1)的mRNA衰減速率,CSE刺激及干擾HuR表達后,檢測ZEB-1表達變化。結(jié)果:(1)C0PD患者肺臟氣道上皮細胞中HuR表達增高免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,C0PD吸煙組中HuR表達顯著高于對照不吸煙組及對照吸煙組,對照吸煙組HuR表達高于對照不吸煙組;HuR表達水平與FEV1存在負相關(guān)性。(2)CSE刺激下BEAS-2B細胞系中HuR表達增高、活性增強BEAS-2B細胞中,CSE刺激促進HuR的表達;蛋白印跡及免疫熒光結(jié)果顯示,CSE刺激后,HuR細胞質(zhì)分布增加,活性增強。(3)小RNA干擾可明顯降低HuR表達水平BEAS-2B中轉(zhuǎn)染3組小RNA序列,分別在RNA水平及蛋白水平檢測HuR表達,有2組序列HuR表達均有明顯的下調(diào)。(4)CSE刺激下BEAS-2B細胞系中HuR在EMT調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用BEAS-2B細胞中CSE處理后,細胞出現(xiàn)EMT相關(guān)改變,E-鈣粘蛋白(上皮細胞標志物)表達降低,波形蛋白(間葉細胞標志物)表達升高,細胞形態(tài)有梭形改變;抑制HuR表達后,EMT標志物及細胞形態(tài)改變均得到部分逆轉(zhuǎn)。(5)HuR介導(dǎo)ZEB-1的調(diào)控BEAS-2B細胞中,與對照相比,HuR干擾后ZEB-1的mmRNA穩(wěn)定性降低,降解速度增快;CSE刺激促進ZEB-1表達,抑制HuR表達后,ZEB-1表達水平降低。結(jié)論:HuR在COPD患者氣道上皮組織中高表達,同時在CSE刺激的氣道上皮BEAS-2B中表達及活性上調(diào)。在BEAS-2B中,HuR參與了對EMT的調(diào)控,并對EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ZEB-1有調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R563.9

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本文編號：1554379