本文關(guān)鍵詞： 慢性阻塞性肺疾病 氣道基底細胞 滋養(yǎng)層細胞表面抗原2 基底細胞增生 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD;簡稱慢阻肺),是一種臨床病理表現(xiàn)復(fù)雜的異質(zhì)性疾病。其病理生理特點是進行性發(fā)展的氣流受限,形成氣流受限的病理基礎(chǔ)在于氣道重塑和肺泡破壞,主要與香煙及生物燃料造成直接破壞以及炎癥損傷有關(guān)。氣道上皮是有害顆粒的直接承受者,在氣道損傷中首當(dāng)其沖。氣道上皮細胞發(fā)生損傷后迅速啟動修復(fù)機制。基底細胞是氣道上皮的干細胞群,在氣道損傷后通過增殖、遷移并分化成新的上皮,完成修復(fù)過程�；准毎δ芪蓙y在慢阻肺氣道上皮損傷后的異常修復(fù)中發(fā)揮舉足輕重的作用:如過度增殖會導(dǎo)致細胞增生,氣道壁增厚;異常分化可以導(dǎo)致鱗狀上皮化生、杯狀細胞增多進而黏液高分泌,這些改變均與慢阻肺早期氣道重塑病理表現(xiàn)密切相關(guān)。深入了解基底細胞的功能和調(diào)控機制,對于慢阻肺的早期干預(yù)具有重要的臨床意義。TROP2(Trophoblast antigen 2,滋養(yǎng)層細胞表面抗原 2),是一種 TACSTD(tumor-associated calcium signal transducer,腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)基因家族跨膜糖蛋白,其高表達可以為上皮源性腫瘤細胞的生長和侵襲提供重要信號。值得關(guān)注的是,新近研究證實TROP2具備調(diào)控干細胞生長的能力。Andrew S等研究發(fā)現(xiàn),前列腺基底細胞中僅高表達TROP2的細胞具備成球能力和分化潛能。在小鼠肝臟中,TROP2可作為卵圓細胞(被認(rèn)為肝臟干細胞)的標(biāo)記,在肝損傷后可檢測到其特異性表達于未分化的卵圓細胞中,且表達量和誘導(dǎo)損傷時間成正比。以上證據(jù)提示,TROP2在干細胞的更新和生長中發(fā)揮重要作用,然而TROP2在慢阻肺氣道基底干細胞表達及其意義未見相關(guān)報道,針對此問題,本課題對慢阻肺患者氣道上皮TROP2表達水平及其對基底細胞的調(diào)控作用進行研究。研究目的檢測慢阻肺患者氣道基底細胞TROP2表達情況,分析其對基底細胞增生、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、炎癥因子分泌等生物學(xué)行為的調(diào)控作用,探討TROP2在慢阻肺氣道上皮重塑中可能發(fā)揮的作用。研究方法1.慢阻肺患者氣道基底細胞TROP2表達1.1病例選擇選取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2012年至2014年因肺部病變行肺葉切除術(shù)患者,收集遠離病變5cm以上肺組織標(biāo)本。病例分組包括:慢阻肺吸煙組(24例),吸煙對照組(24例),和不吸煙對照組(24例)。1.2免疫組化染色檢測氣道上皮TROP2表達;基底細胞標(biāo)志物Cytokeratin 5和TROP2免疫熒光雙重染色對TROP2在氣道上皮中的表達進行定位分析。1.3對TROP2表達水平和FEV%進行相關(guān)性分析。1.4免疫組化染色檢測三組樣本的氣道上皮增生指數(shù)Ki67(%)。1.5對TROP2表達水平和氣道上皮增生指數(shù)Ki67(%)進行相關(guān)性分析。2.TROP2對氣道基底細胞增殖的影響及機制研究2.1氣道基底細胞的分離、培養(yǎng):選取就診于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院行常規(guī)纖維支氣管鏡的患者(包括肺功能正常者和輕、中度慢阻肺患者)進行上皮細胞刷檢。應(yīng)用BEGM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)基底細胞。使用基底細胞標(biāo)志物Cytokeratin 5、p63行免疫熒光雙標(biāo)記,鑒定氣道基底細胞。2.2過表達及沉默TROP2基因:構(gòu)建pcDNA3.1-TROP2質(zhì)粒及siRNA-TROP2序列,采用脂質(zhì)體Lipo 2000進行細胞轉(zhuǎn)染。pcDNA3.1-TROP2轉(zhuǎn)染至正�；准毎筎ROP2高表達,siRNA-TROP2轉(zhuǎn)染至慢阻肺基底細胞使TROP2低表達。轉(zhuǎn)染48小時后應(yīng)用Western blot和RT-PCR方法驗證轉(zhuǎn)染效果。2.3實驗分為處理組(TROP2基因轉(zhuǎn)染或沉默的基底細胞)和對照組(包括陰性對照和空白對照),通過CCK-8檢測、細胞周期檢測、劃痕實驗明確TROP2上調(diào)或沉默對氣道基底細胞增殖和損傷修復(fù)能力的影響。2.4 TROP2促氣道基底細胞增殖機制研究:上調(diào)TROP2表達,Western blot方法檢測磷酸化的ERK1/2水平,以及ERK下游信號分子細胞周期蛋白Cyclin D1的表達;為明確PERK1/2在TROP2促基底細胞增殖中的作用,使用ERK抑制劑U0126預(yù)處理細胞,檢測ERK蛋白磷酸化水平及Cyclin D1表達水平;CCK-8檢測基底細胞增殖情況。3.TROP2對氣道基底細胞EMT樣改變和炎癥因子分泌的影響3.1慢阻肺氣道基底細胞EMT標(biāo)志物檢測:免疫熒光雙染檢測慢阻肺及對照組的氣道上皮中Cytokeratin 5及Vimentin(間質(zhì)細胞標(biāo)志物)表達。3.2 TROP2對氣道基底細胞EMT標(biāo)志物表達的影響:TROP2基因轉(zhuǎn)染正常氣道基底細胞,使TROP2過表達,Western blot檢測EMT標(biāo)志物E-cadherin及Vimentin變化;收集來自慢阻肺患者的氣道基底細胞進行體外培養(yǎng),沉默基底細胞TROP2后,檢測EMT標(biāo)志物變化。3.3 TROP2對基底細胞炎癥因子分泌的影響:將pcDNA3.1-TROP2質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染氣道基底細胞,應(yīng)用ELISA方法檢測TROP2過表達和對照組細胞上清液中IL-6、IL-8、IL-1 β、TNF-α表達水平。3.4炎癥因子在TROP2促氣道基底細胞EMT改變中作用的研究:IL-6、IL-8、IL-1β中和抗體預(yù)處理TROP2過表達基底細胞,Western Blot檢測EMT標(biāo)志物變化。3.5 ERK1/2在TROP2促基底細胞EMT改變和炎癥因子分泌中作用的研究:使用ERK1/2抑制劑U0126預(yù)處理TROP2過表達基底細胞,ELISA方法檢測上清液中IL-6、IL-8、IL-1β表達水平,Western Blot檢測EMT標(biāo)志物改變。結(jié)果1.肺組織標(biāo)本研究1.1 一般資料比較:三組病人年齡上無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.74)。COPD吸煙組及吸煙對照組的吸煙指數(shù)無顯著差異(P=0.10)。COPD吸煙組FEV1%與FEV1/FVC均顯著低于吸煙對照組和非吸煙對照組(P0.05,P0.05)。吸煙對照組與非吸煙對照組的FEV,%、FEV1/FVC 無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.41,P=0.30)。1.2慢阻肺氣道基底細胞TROP2表達上調(diào):COPD吸煙組氣道上皮TROP2呈強陽性表達(P0.05,P0.05)。免疫熒光雙染結(jié)果顯示,TROP2和Cytokeratin 5在氣道基底部位重合染色,表明高表達的TROP2蛋白來源于慢阻肺患者氣道基底細胞。1.3 TROP2表達水平與氣流受限密切相關(guān):氣道基底細胞TROP2表達量與FEV1%呈負相關(guān)(r=-0.53,P0.01)。1.4慢阻肺氣道上皮ki67表達增多:免疫組化染色結(jié)果顯示,慢阻肺患者氣道上皮Ki67陽性染色細胞數(shù)明顯增多。Ki67陽性細胞比率(%)在正常對照組、吸煙對照組和COPD吸煙組的表達逐漸升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。1.5 TROP2表達量和Ki67顯著相關(guān):在慢阻肺肺組織樣本中,TROP2和Ki67陽性染色細胞比率(%)呈顯著正相關(guān),具有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.878,P0.01)。2.TR0P2對基底細胞增殖的影響及機制研究2.1氣道基底細胞鑒定:細胞免疫熒光染色顯示,細胞同時表達基底細胞標(biāo)志物Cytokeratin 5和p63(95%),鑒定為氣道基底細胞。2.2成功構(gòu)建TROP2過表達及低表達基底細胞模型:TROP2基因轉(zhuǎn)染基底細胞48小時后,轉(zhuǎn)染組TROP2 mRNA表達量較對照組提高約4倍(P0.05);蛋白表達量較對照組增高約2.5倍(P0.05)。siRNA轉(zhuǎn)染慢阻肺基底細胞48小時后,TROP2mRNA表達量較對照組降低約75%(P0.05),蛋白表達量較對照組降低約60%(P0.05)。2.3TROP2過表達促進細胞增殖及損傷修復(fù):CCK-8結(jié)果表明,TROP2過表達的細胞增殖能力較對照組細胞明顯增加(P0.05)。流式細胞術(shù)檢測TROP2過表達后細胞周期分布的改變,G1期細胞較對照組減少,進入S期細胞顯著增多(P0.05)。在劃痕損傷后24和48小時,TROP2過表達基底細胞相對損傷面積明顯低于對照組細胞(P0.05)。2.4 TROP2基因沉默減弱基底細胞增殖及損傷修復(fù):CCK8生長曲線結(jié)果顯示,下調(diào)慢阻肺基底細胞TROP2表達后,增殖能力明顯降低(P0.05),細胞周期示S期比例降低(P0.05);劃痕24小時和48小時后,TROP2沉默組細胞修復(fù)能力顯著減弱(P0.05)。2.5 ERK/MAPK信號通路在TROP2促基底細胞增殖中發(fā)揮作用:TROP2基因轉(zhuǎn)染48小時后,ERK蛋白的磷酸化增加,CyclinD1表達增多(P0.05)。U0126預(yù)處理細胞后,TROP2誘導(dǎo)的ERK蛋白磷酸化顯著降低,CyclinD1表達減少(P0.05);CCK-8試驗顯示U0126預(yù)處理的pcDNA3.1-TROP2細胞增殖能力較未處理組降低(P0.05),表明pERK1/2可能參與了 TROP2對基底細胞增殖的調(diào)控作用。3.TROP2促進氣道基底細胞EMT樣改變和炎癥因子分泌3.1 慢阻肺氣道基底細胞存在EMT現(xiàn)象:肺組織免疫熒光雙染結(jié)果顯示,部分Cytokeratin5+基底細胞有Vimentin陽性著色,慢阻肺基底細胞Vimentin染色陽性細胞比率較對照顯著增多(P0.05)。3.2 TROP2促進氣道基底細胞EMT標(biāo)志物表達:TROP2過表達組Vimentin表達較陰性對照和空白對照細胞明顯增多,E-cadherin表達降低(P0.05)。沉默慢阻肺基底細胞TROP2后,基底細胞E-cadherin表達增加,間質(zhì)細胞標(biāo)志物Vimentin表達減低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3.3TROP2過表達促進基底細胞分泌炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β:TROP2轉(zhuǎn)染48小時,細胞上清液中IL-6、IL-8、IL-1 β較陰性對照顯著增加(P均0.05)。在三組細胞的TNF-a水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3.4抑制炎癥因子對TROP2促氣道基底細胞EMT樣改變無明顯影響:使用中和抗體阻斷IL-6、IL-8、IL-1β后,TROP2過表達基底細胞的E-cadherin和Vimentin表達較對照組無顯著差異(P0.05)。3.5抑制ERK1/2對TROP2促基底細胞EMT樣改變和炎癥因子分泌無顯著影響:使用U0126預(yù)處理細胞,TROP2過表達后氣道基底細胞EMT改變和炎癥因子分泌均未受明顯影響(P0.05;P0.05)。結(jié)論:1.TROP2在慢阻肺氣道基底細胞中顯著高表達,TROP2表達水平與氣道上皮增生指數(shù)及肺功能氣流阻塞程度顯著正相關(guān)。2.體外細胞實驗表明,TROP2過表達能夠促進氣道基底細胞增殖,這種作用可能通過ERK/MAPK信號途徑實現(xiàn)。3.TROP2能夠促進氣道基底細胞發(fā)生EMT樣改變,并促進炎癥因子IL-6、IL-8和IL-1β釋放,可能在慢阻肺氣道重塑中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R563.9

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本文編號：1543396