發(fā)布時(shí)間：2018-02-27 04:09

  本文關(guān)鍵詞： 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞 脂多糖 炎癥 維生素D　出處：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：膿毒癥所致急性呼吸窘迫綜合征（acute respirarory distress syndrome，ARDS）為臨床常見危重癥，肺泡上皮細(xì)胞損傷是其主要病理改變之一。研究顯示維生素D除具有經(jīng)典的調(diào)節(jié)鈣磷平衡作用外，還具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等廣泛的骨外生物學(xué)效應(yīng)。目前有關(guān)維生素D在組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞，，特別是膿毒癥時(shí)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cell typeⅡ，ATⅡ）中干預(yù)作用的研究相對(duì)少見。本研究選取人ATⅡ細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對(duì)象，以脂多糖為刺激因素，探究維生素D對(duì)ATⅡ炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用及相關(guān)機(jī)制，為臨床防治膿毒癥型ARDS提供理論依據(jù)。 方法： 1.以體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞為研究對(duì)象，首先，按照對(duì)照組、LPS刺激組（1μg/ml）、 LPS＋25(OH)D3（100nmol/L）干預(yù)組、 LPS＋1,25(OH)_2D_3（100nmol/L）干預(yù)組、25(OH)D（3100nmol/L）干預(yù)組、1,25(OH)2D（3100nmol/L）干預(yù)組分組；再次，按照1,25(OH)_2D_3（100nmol/L）的不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)（LPS刺激前24小時(shí)、LPS刺激前16小時(shí)、LPS刺激前6小時(shí)、LPS刺激前3小時(shí)、同時(shí)給藥、LPS刺激后3小時(shí)、LPS刺激后6小時(shí)）分組；最后，按照1,25(OH)_2D_3的不同給藥濃度（10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L）分組；以LPS的給藥時(shí)間為起點(diǎn)，24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。另外，給予1,25(OH)_2D_3（1μmol/L）干預(yù)，分別于LPS刺激6小時(shí)、12小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子白介素（interleukin，IL）-8的表達(dá)水平。 2.按照對(duì)照組、LPS刺激組（1μg/ml）、LPS＋1,25(OH)_2D_3（10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L）干預(yù)組分組；于LPS刺激A549細(xì)胞24小時(shí)后應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。 3．應(yīng)用免疫組化、免疫熒光方法檢測(cè)人正常肺組織中ATⅡ及A549細(xì)胞維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）、1-羥化酶（CYP27B1）的表達(dá)分布。 4.按照對(duì)照組、LPS刺激組、LPS＋1,25(OH)_2D_3（1μmol/L）干預(yù)組、1,25(OH)_2D_3（1μmol/L）干預(yù)組分組，在LPS刺激30分鐘和24小時(shí)后收集細(xì)胞提取總蛋白，應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)NF-κB p65、IκB-蛋白的表達(dá)水平；應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)NF-κB p65的表達(dá)及核轉(zhuǎn)位。 結(jié)果： 1.1,25(OH)_2D_3可顯著降低A549細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后炎癥因子IL-8的表達(dá)水平（P0.05），而25(OH)D3僅輕度降低IL-8的表達(dá)水平，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；1,25(OH)_2D_3在七個(gè)不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)均可顯著降低炎癥因子IL-8的表達(dá)水平（P0.05），其中在LPS刺激前24小時(shí)給藥最為明顯；三個(gè)不同給藥濃度的1,25(OH)_2D_3均可顯著降低炎癥因子IL-8的表達(dá)水平（P0.05），其中高濃度組最為明顯；1,25(OH)_2D_3在LPS刺激后6小時(shí)及12小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均可顯著降低炎癥因子IL-8的表達(dá)水平（P0.05）。 2. LPS（1μg/ml）組細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組明顯下降（P0.05），在LPS刺激前24小時(shí)給予1,25(OH)_2D_3（10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L）干預(yù)與LPS刺激組比較未顯著影響細(xì)胞增殖活力。 3．VDR和CYP27B1在人正常肺組織ATⅡ中均有表達(dá)，VDR表達(dá)于胞核和胞漿處，CYP27B1主要表達(dá)于細(xì)胞漿。與正常ATⅡ有所不同，A549細(xì)胞的VDR主要表達(dá)于核膜和胞漿處，并且在A549細(xì)胞中未檢測(cè)到CYP27B1的表達(dá)。 4．1,25(OH)_2D_3在30分鐘和24小時(shí)可顯著升高A549細(xì)胞和經(jīng)LPS刺激后A549細(xì)胞IκB-總蛋白的表達(dá)水平，而對(duì)NF-κB p65總蛋白的表達(dá)水平無(wú)顯著影響；免疫熒光檢測(cè)顯示1,25(OH)_2D_3可抑制LPS刺激后A549細(xì)胞NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位。 結(jié)論： 1．1,25(OH)_2D_3可顯著抑制LPS致傷A549細(xì)胞炎癥因子IL-8的表達(dá)，抑制程度隨給藥濃度的增加而增強(qiáng)，并且在LPS刺激前24小時(shí)干預(yù)時(shí)其抗炎作用效果最為明顯。 2．1,25(OH)_2D_3對(duì)LPS致傷A549細(xì)胞的增殖活力無(wú)顯著影響。 3．VDR和CYP27B1在人正常肺組織ATⅡ中均有表達(dá)，提示正常ATⅡ具有局部合成1,25(OH)_2D_3的可能，而A549細(xì)胞僅表達(dá)VDR，未檢測(cè)到CYP27B1的表達(dá)，這可能是給予25(OH)D3不能在A549細(xì)胞局部經(jīng)CYP27B1催化為1,25(OH)_2D_3，而發(fā)揮抗炎作用的原因之一。 4．1,25(OH)_2D_3可能通過上調(diào)IκB-蛋白的表達(dá)，抑制NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而使其下游炎癥因子IL-8的表達(dá)下調(diào)，從而發(fā)揮抗炎作用。
[Abstract]:Objective: sepsis induced acute respiratory distress syndrome (acute respirarory distress syndrome, ARDS) is a common clinical critical disease, alveolar epithelial cell injury is the main pathological one. Studies suggest that vitamin D is in addition to the classical regulation of calcium and phosphorus balance effect, also has the bone biological effects of immunoregulation and anti tumor etc at present. The vitamin D in the structure of cells, especially in sepsis of type II alveolar epithelial cells (alveolar epithelial cell type II, AT II) study the intervention effects are relatively rare. This study selected AT II cell line A549 as the research object, using LPS as stimuli to explore the intervention effect of vitamin D the AT II inflammatory reaction and mechanism, to provide theoretical basis for clinical prevention and treatment of sepsis and ARDS.
Method錛

本文編號(hào)：1541043