本文關(guān)鍵詞： 游離二氧化硅 甲基化 成纖維細胞 轉(zhuǎn)分化　出處：《鄭州大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：轉(zhuǎn)分化是指一種分化完全的細胞在某些因素的刺激下,丟失其原有的表型特點而轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌愋图毎?是一種特定的生理或病理過程。在矽肺發(fā)生過程中,游離二氧化硅刺激肺泡巨噬細胞(Alveolar macrophage,AM)分泌各類活性介質(zhì),尤其是轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1、TGF-β1),誘導(dǎo)肺成纖維細胞(Lung fibroblast,LF)轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞(Myo fibroblast,MF),其α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及膠原蛋白的表達上調(diào),且凋亡受到抑制,促進細胞增殖和膠原合成,最終引起肺纖維化。游離二氧化硅刺激成纖維細胞轉(zhuǎn)分化過程中涉及大量基因和蛋白的改變,以往傳統(tǒng)遺傳學(xué)研究尚未解釋其確切機制。與傳統(tǒng)遺傳學(xué)相比,表觀遺傳學(xué)的改變更常見,而且其改變是可逆的。表觀遺傳學(xué)調(diào)控在其他纖維化中的成纖維細胞轉(zhuǎn)分化過程中發(fā)揮了重要作用,且有可能成為作為逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)分化或降低轉(zhuǎn)分化程度的干預(yù)靶點。所以研究矽肺纖維化中成纖維細胞轉(zhuǎn)分化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制具有十分重要的意義。 目的 通過建立肺纖維化體外細胞模型,模擬游離二氧化硅誘導(dǎo)大鼠肺成纖維細胞轉(zhuǎn)分化的過程,檢測基因組的甲基化水平,甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基結(jié)合蛋白的mRNA及蛋白水平的表達情況。為擴展對肺纖維化發(fā)生發(fā)展規(guī)律的認識提供表觀遺傳學(xué)實驗基礎(chǔ),并為肺纖維化疾病的研究提供新的思路。 方法 1.矽肺纖維化體外細胞模型建立。采用ThinCertTM共培養(yǎng)模型,肺灌洗獲取巨噬細胞；胰蛋白酶消化法分離和純化肺成纖維細胞,在37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)。取4-8代的成纖維細胞接種于6孔板內(nèi),細胞融合至80%-90%時,在ThinCertTM內(nèi)接種約3×105個巨噬細胞,懸掛于6孔板的孔內(nèi)進行共培養(yǎng)。間接培養(yǎng)模型,游離二氧化硅刺激巨噬細胞后的上清液,經(jīng)離心后加入接種有成纖維細胞的6孔板內(nèi),在37℃、5%CO2條件下進行進行共培養(yǎng)。 2.肺成纖維細胞轉(zhuǎn)分化鑒定。將游離二氧化硅均勻混入無血清DMEM培養(yǎng)基中,終濃度分別為25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml,經(jīng)模型共培養(yǎng)后,對成纖維細胞進行檢測。Real-Time PCR檢測α-SMA、Ⅰ型膠原(Collagen Ⅰ,COL Ⅰ)及Ⅲ型膠原(Collagen Ⅲ,COL Ⅲ)的mRNA水平；ELISA法測定α-SMA、COLⅠ和COL Ⅲ的蛋白表達水平。 3.成纖維細胞的基因組甲基化水平檢測。用無血清的游離二氧化硅為刺激物,以0μg/ml為空白組,處理組分別加入25μg/ml、50gg/ml、100gg/ml濃度的游離二氧化硅,培養(yǎng)24h。DAC組以5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,DAC)3μmol/L預(yù)處理成纖維細胞24h后,在ThinCertTM內(nèi)加入100μg/ml濃度的游離二氧化硅,培養(yǎng)24h。成纖維細胞提取基因組總DNA經(jīng)水解后,采用高效液相色譜法測定基因組DNA中的脫氧胞苷(Deoxycytidine,dC)和5-甲基脫氧胞苷(5-Methyl-2'-deoxycytidine,5-dmC)的含量。 4.DNA甲基化相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達的檢測。Real-Time PCR檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA(cytosine-5)-methyltransferase1,DNMT1)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a(DNA(cytosine-5)-methyltransferase3a,DNMT3a)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(DNA(cytosine-5)-methyltransferase3b,DNMT3b)、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白2(Methyl-CpG binding domain protein2,MBD2)和甲基CpG結(jié)合蛋白2(Methyl CpG binding protein2,MeCP2)的mRNA水平；ELISA法測定DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD2和MeCP2的蛋白表達水平。 結(jié)果 1.顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)的SD大鼠胸腔巨噬細胞、肺成纖維細胞體外生長良好,可以用于體外實驗研究,模型中細胞也生長正常,可用于實驗。 2.肺成纖維細胞轉(zhuǎn)分化鑒定：ThinCertTM共培養(yǎng)模型中,游離二氧化硅處理組的細胞α-SMA、COL Ⅰ和COL Ⅲ的表達明顯高于0μg/ml組(P0.05),且隨游離二氧化硅濃度增高,肺成纖維細胞表達α-SMA、COL Ⅰ和COL Ⅲ的量也逐漸增多。與間接共培養(yǎng)模型相比,各組別的細胞α-SMA、COL Ⅰ和COL Ⅲ的表達均高于間接共培養(yǎng)相同組別。 3.基因組DNA中的dC和5-dmC的含量的檢測結(jié)果：與0μg/ml組(5.53%±0.044%)相比,25μg/ml(4.30%±0.067%)、50μg/ml(3.86±0.062%)、100μg/ml(3.50%±0.036%)游離二氧化硅劑量組成纖維細胞的基因組甲基化水平分別降低22.2%、30.2%、36.7%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與100μg/ml游離二氧化硅劑量組相比,DAC組(2.78%±0.065%)DAC處理后成纖維細胞基因組甲基化水平降低20.6%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4.甲基化相關(guān)酶和甲基結(jié)合蛋白的mRNA及蛋白表達的檢測結(jié)果：與0gg/ml組細胞相比,25μg/ml組細胞DNMT1的mRNA的表達水平無明顯改變,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；50μg/ml、100μg/ml和DAC組細胞分別降低18.7%、27.6%、42.1%和64.4%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 與0μg/ml組細胞相比,25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和DAC組細胞DNMT3a的mRNA的表達水平分別降低14.5%、29.5%、38.5%和52.2%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 與0μg/ml組細胞相比,DAC組細胞DNMT3b的mRNA的表達水平降低35.5%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；其它組細胞無明顯變化,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 與0μg/ml組細胞相比,25μg/ml、50μg/ml組細胞MBD2的mRNA的表達水平無明顯改變,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)：100μg/ml和DAC組細胞分別降低14.5%和56.8%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 與0μg/ml組細胞相比,DAC組細胞MeCP2的mRNA的表達水平降低71.5%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；其它組細胞無明顯變化,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 各基因的蛋白表達水平和mRNA的表達水平具有一致性。與0μg/ml組細胞相比,游離二氧化硅處理組細胞DNMT1、DNMT3a和MBD2的蛋白水平的表達有所降低；DAC組細胞表達最低；DNMT3b和MeCP2的蛋白水平表達無明顯變化。 結(jié)論 1.利用ThinCertTM小體改良后的體外細胞共培養(yǎng)模型建立成功,用于矽肺研究中游離二氧化硅誘導(dǎo)肺成纖維細胞轉(zhuǎn)分化的實驗。 2.矽肺體外共培養(yǎng)細胞模型中,成纖維細胞基因組甲基化水平在游離二氧化硅作用下,在DNMT1、DNMT3a和MBD2的調(diào)節(jié)下呈劑量依賴性降低。
[Abstract]:The expression of 偽 - smooth muscle actin ( 偽 - SMA ) and collagen is up - regulated in the process of pulmonary fibrosis . Purpose By establishing an in vitro cell model of pulmonary fibrosis , the expression of methylation level , mRNA and protein level in lung fibroblasts induced by free silica was simulated . method 1 . In vitro cell model of silicotic fibrosis was established . The lung fibroblasts were isolated and purified by using ThinCertTM co - culture model and lung lavage . The cells were cultured under the condition of 37 鈩，

本文編號：1527082