本文關鍵詞： 埃茲蛋白 腫瘤壞死因子 肺微血管內皮細胞 Rac1 急性呼吸窘迫綜合征　出處：《安徽醫(yī)科大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景與目的埃茲蛋白(Ezrin)是細胞骨架橋接蛋白ERM(Ezrin-Radixin-Moesin)家族成員之一,主要分布于細胞皮層。Ezrin作為膜蛋白和肌動蛋白連接蛋白,通過ERM家族特征性FERM(four-point-one protein,ezrin,redixin,moesin)功能域將胞膜蛋白與肌動蛋白連接,參與多種信號傳導,在調控細胞的形態(tài)、生長、生存、黏附、增殖和遷徙等生物學功能中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),用特異性Ezrin小干擾RNA作用于腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)刺激的人肺微血管內皮細胞(Human pulmonary microvascular endothelial cell,HPMVEC),磷酸化的Ezrin減少,可顯著抑制內皮細胞通透性的增加。但在肺炎癥損傷過程中,Ezrin具體通過哪些信號傳導通路參與其中,尚未見報道。本研究通過TNF-α建立大鼠肺微血管內皮細胞(rat pulmonary microvascular endothelial cell,RPMVEC)損傷模型,探討RPMVEC炎性損傷與Ezrin表達量及磷酸化之間的關系,以及Ezrin在急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)發(fā)病機制中的作用和小G蛋白家族成員Rac1對Ezrin在TNF-α致RPMVEC炎性損傷中的影響。方法1)體外肺組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原代RPMVECs;2)蛋白質免疫印跡技術(Western-blotting technique)檢測TNF-α刺激RPMVECs后各時間點Ezrin及其磷酸化的表達水平。3)蛋白質免疫印跡技術測定NSC23766刺激RPMVECs后不同時間點Ezrin及p-Ezrin的表達;結果1)體外成功分離培養(yǎng)出原代RPMVECs,經光鏡下的細胞形態(tài)學及植物凝集素結合實驗鑒定。2)RPMVECs中僅低量表達Ezrin,且TNF-α刺激對Ezrin無明顯影響。10μg/L TNF-α刺激RPMVECs不同時間(0h、0.25h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h)后發(fā)現(xiàn):Ezrin表達無變化。而TNF-α可呈時間依賴性增加Ezrin磷酸化,相對表達量分別為(0.21±0.33)、(0.53±0.19)、(0.95±0.24)、(1.07±0.30)、(1.68±0.30)、(1.32±0.37)、(0.93±0.20)、(0.87±0.18),0.25 h(0.53±0.19)時開始高于0 h(0.21±0.33),3h(1.68±0.30)達峰值且顯著高于0 h、0.25 h、0.5 h、1 h、6 h、12 h、24 h(均P0.001),24 h(0.87±0.18)仍高于0 h。各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=62.2,P0.001)。3)與空白對照組(0.68±0.16)比較,單獨使用10μg/L TNF-α(0.92±0.12)或200μmol/L NSC 23766(1.33±0.24)刺激均能誘導p-Ezrin表達量增加(t=-2.864、P=0.020,t=-5.429、P=0.000);將NSC 23766與TNF-α共同刺激(2.14±0.18)能明顯提高p-Ezrin表達量,與TNF-α(0.92±0.12)單獨刺激組比較有統(tǒng)計學差異(t=-14.670,P0.001)。結論1)RPMVECs僅低量表達Ezrin,TNF-α刺激對Ezrin無明顯影響。2)TNF-α以時間依賴的方式上調PMVEC中磷酸化Ezrin的表達。3)抑制Rac1信號通路可通過上調Ezrin磷酸化表達參與TNF-α對RPMVECs的致傷效應。
[Abstract]:Background & objective Ezrinin is a member of the Ezrin-Radixin-Moesin family of cytoskeleton bridging proteins. Ezrin mainly distributes in the cell cortex as membrane protein and actin junction protein. Cellular membrane proteins are connected with actin through the functional domain of ERM family FERM(four-point-one protein FERM(four-point-one protein redix in moesin, which play an important role in regulating cell morphology, growth, survival, adhesion, proliferation, migration and other biological functions, and play an important role in the regulation of cell morphology, growth, survival, adhesion, proliferation and migration. Human pulmonary microvascular endothelial cells (HPMVECs) stimulated by tumor necrosis factor- 偽 (TNF- 偽) were treated with specific Ezrin small interfering RNA, and phosphorylated Ezrin was decreased. But in the process of lung inflammation injury, which signal transduction pathways does Ezrin take part in? In this study, we established rat pulmonary microvascular endothelial cell model by TNF- 偽 to investigate the relationship between RPMVEC inflammatory injury and Ezrin expression and phosphorylation. The role of Ezrin in the pathogenesis of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and the effect of small G protein family member Rac1 on Ezrin in RPMVEC inflammatory injury induced by TNF- 偽. Methods 1) isolation and culture of primary RPMVECs2 eggs by adherent lung tissue mass in vitro). Western blotting technique was used to detect the expression level of Ezrin and its phosphorylation at different time points after TNF- 偽 stimulated RPMVECs. The expression of Ezrin and p-Ezrin at different time points after RPMVECs stimulated by NSC23766 were detected by Western blotting technique. Results 1) Primary RPMVECs were isolated and cultured successfully in vitro. The results of cell morphology and phytoagglutinin binding experiments under light microscope showed that the expression of Ezrinin in the RPMVECs was only low, and TNF- 偽 stimulation had no significant effect on Ezrin. 10 渭 g / L TNF- 偽 stimulated RPMVECs for 0 h 0.25 h, 0.5 h 1 h, 1 h 3 hU 6 h ~ 12 h ~ 24 h). TNF- 偽 could increase the phosphorylation of Ezrin in a time dependent manner. The relative expression levels were 0.21 鹵0.33, 0.53 鹵0.19, 0.95 鹵0.24, 1.07 鹵0.30, 1.32 鹵0.371.32 鹵0.371.32 鹵0.371.32 鹵0.370.87 鹵0.18h0.53 鹵0.19, respectively, and reached a peak value of 0.21 鹵0.33, 1.68 鹵0.30) and significantly higher than 0 h, 0.25 h, 0.5 h, 1 h, 6 h, 12 h, 24 h (all P 0.001h, 0.87 鹵0.18). The difference between the two groups was statistically significant compared with that of the control group (0.68 鹵0.16). 10 渭 g / L TNF- 偽 0.92 鹵0.12) or 200 渭 mol/L NSC 237661.33 鹵0.24) increased the expression of p-Ezrin, increased the expression of p-Ezrin, increased the expression of p-Ezrin, increased the expression of p-Ezrin by co-stimulation of NSC 23766 and TNF- 偽. Compared with TNF- 偽 0.92 鹵0.12) alone, there was a significant difference between TNF- 14.670 and P0.0010.Conclusion only the low expression of Ezrinine TNF- 偽 in RPMVECs has no effect on Ezrin. 2TNF- 偽 upregulated the expression of phosphorylated Ezrin in PMVEC in a time-dependent manner. 3) inhibited Rac1 signaling pathway by up-regulating Ezrin phosphorylation. The expression of TNF- 偽 was involved in the injury effect of TNF- 偽 on RPMVECs.
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R563.8

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本文編號：1515483