本文關(guān)鍵詞： 機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷 NLRP3 炎癥 線粒體　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的機(jī)械相關(guān)性肺損傷(ventilator-induced lung injury,VILI)是一種在應(yīng)用呼吸機(jī)過程中由于機(jī)械張力的各種因素作用于肺組織引起的以肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡腔充血出血為病理特征的綜合征,臨床多表現(xiàn)為肺水腫及呼吸功能障礙。非生理性牽張除了通過機(jī)械剪切力破壞血氣功能屏障,使細(xì)胞膜通透性增加之外,還能激活體內(nèi)的炎癥信號通路,導(dǎo)致白細(xì)胞和各種促炎因子在損傷部位聚集,導(dǎo)致肺部產(chǎn)生炎癥應(yīng)答,啟動和加重肺組織損傷。在機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)中NLRP3炎性蛋白及炎性體也發(fā)揮著重要功能,其中NLRP3蛋白能夠通過Toll樣受體4(Toll Like Receptor 4,TLR4)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄信號發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯,生成增加并使炎性體聚合,最終通過蛋白水解作用將無活性的炎性因子前體pro-IL-1β轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒齑傺滓蜃覫L-1β并釋放至細(xì)胞外,引起機(jī)體的炎癥損傷,在NLRP3蛋白活化過程中線粒體來源的活性氧族(Reactive Oxygen Species,ROS)起到了扳機(jī)作用,線粒體功能受損會導(dǎo)致線粒體膜電位(Mitochondria Membrane Potential,MMP)水平降低,發(fā)生ATP生成障礙、ROS異常生成增加等一系列后果,這些后果均會引起并加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。因此,本研究通過體內(nèi)試驗和體外試驗來研究NLRP3蛋白與線粒體功能在VILI發(fā)生發(fā)展過程中的變化。研究方法體內(nèi)試驗:SPF級C57BL/6小鼠30只,8-10周齡,體重20-25g,雌雄各半,隨機(jī)分配成3組(n=10):對照組(Conrol,C組),機(jī)械通氣組(Mechanical Ventilation,MV 組),機(jī)械通氣+TLR4 阻斷劑組(Mechanical Ventilation+TAK-242,MV+T組)。對C組小鼠做氣管切開后不進(jìn)行氣管插管,自由通氣;MV組、MV+T組行機(jī)械通氣,RR=70次/min,VT=15ml/kg,I:E)=1:2,吸入氧濃度為21%,通氣時間為4h。MV+T組在麻醉前用TLR4阻斷劑TAK-242(3mg/kg)預(yù)處理1h。機(jī)械通氣結(jié)束后,剪下右上肺放入EP管中,盡快使用液氮將其冷凍備用,后續(xù)蛋白免疫印跡法測NLRP3蛋白及NFκB-P65和磷酸化的NFκB-P65(NFκB-pP65);右肺下葉在4%多聚甲醛中固定48h后,進(jìn)行HE染色;止血鉗鉗夾左側(cè)肺根,使用1ml注射器抽取預(yù)冷在4℃冰箱中的生理鹽水緩慢注入對肺組織,充分灌洗肺組織3次,0.3ml/次,并將灌洗液(BALF)注入凍存管中,盡快放入-80℃保存,BALF用于檢測BALF中炎性因子IL-1β濃度。體外試驗:單層培養(yǎng)MLE—12細(xì)胞,隨機(jī)分為4組:對照組(C組)、20%牽張組(CS組)、20%+TLR4阻斷劑組(CS+T組)以及線粒體電子傳遞鏈解偶聯(lián)劑cccp組(cccp組),CS組與CS+T組使用細(xì)胞牽張儀進(jìn)行循環(huán)性牽拉,牽張儀參數(shù)設(shè)置為:0.5 Hz,牽張和放松的時間比:1:1,牽張時間均為4小時,其中CS+T組行牽張前1h用TLR4阻斷劑TAK-242(1uM)進(jìn)行預(yù)處理。cccp組在后續(xù)進(jìn)行實驗前30min用線粒體呼吸鏈解偶聯(lián)劑cccp(10uM)進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理及機(jī)械牽張結(jié)束后,每組留取等量細(xì)胞上清液置于凍存管迅速保存-80℃冰箱,用于檢測細(xì)胞上清液IL-1β濃度;提前準(zhǔn)備好冰袋,每組3孔細(xì)胞置于冰上提取蛋白總量,用于Western Blotting測NLRP3蛋白及NFκB-P65和磷酸化的NFκB-P65(NFκB-pP65)表達(dá)量;剩余細(xì)胞用JC-1法按照說明書處理后用流式細(xì)胞儀檢測PE-A通道(紅)、FITV-A通道(綠)平均熒光強度和線粒體來源的ROS生成量。結(jié)果:體內(nèi)實驗:1、HE染色發(fā)現(xiàn):大潮氣量機(jī)械通氣后小鼠肺泡細(xì)胞連接斷裂、肺泡壁增厚,肺泡腔內(nèi)充血出血,伴隨肺泡腔內(nèi)透明膜形成。使用TLR4阻斷劑后行大潮氣量機(jī)械通氣組肺泡腔內(nèi)充血、出血減少,肺泡壁斷裂、增厚均減少。2、western blotting發(fā)現(xiàn),與C組和MV+T組相比MV組NLRP3蛋白和磷酸化的NFκB-P65表達(dá)均增加,其中MV+T組NLRP3蛋白和磷酸化的NFκB-P65表達(dá)較C組增加,但較MV組減少。3、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)發(fā)現(xiàn),與C組IL-1β濃度相比,MV組和MV+T組炎性因子表達(dá)量顯著增加(P0.05),其中MV+T組IL-1β濃度較MV組降低。體外實驗:1、western blotting發(fā)現(xiàn),與C組相比,其余三組NLRP3蛋白和磷酸化的NFκB-P65表達(dá)量均顯著增加,CS+T組NLRP3蛋白和NFκB-pP65表達(dá)量均降低,cccp組與CS組蛋白表達(dá)量無明顯差異。2、流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),與C組相比,CS組、CS+T組和cccp組細(xì)胞MMP顯著下降,與CS組相比cccp組MMP水平無顯著差異,加入TLR4阻斷劑后行機(jī)械牽張,細(xì)胞MMP水平較CS組提高。3、ELISA發(fā)現(xiàn),IL-1β濃度在C組較其余三組低,與CS組相比,cccp組IL-1β濃度無明顯變化,CS+T組IL-1β濃度較CS組明顯降低。結(jié)論:大潮氣量機(jī)械通氣能促進(jìn)體內(nèi)NLRP3炎性蛋白的生成和激活,繼而導(dǎo)致線粒體MMP下降;引起肺泡上皮細(xì)胞線粒體功能障礙,進(jìn)一步激活炎性體,二者相輔相成惡性循環(huán)共同加重VILI。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R563

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本文編號：1510762