本文關(guān)鍵詞： 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 小窩蛋白-1 原位雜交 脂多糖 蛋白激酶C　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的研究脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（ratpulmonary microvascular endothelial cell, RPMVEC）中小窩蛋白-1（caveolin-1,Cav-1）mRNA表達(dá)的影響，觀察蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）抑制劑對(duì)LPS誘導(dǎo)的Cav-1mRNA表達(dá)的干預(yù)作用，為進(jìn)一步研究Cav-1在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome, ALI/ARDS）發(fā)病機(jī)制中的作用及地位奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法體外分離培養(yǎng)RPMVEC；分別采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptpolymerase chain reaction, RT-PCR）及免疫熒光檢測(cè)RPMVEC中Cav-1mRNA及蛋白的表達(dá)；根據(jù)LPS刺激的濃度和時(shí)間差異，將RPMVEC隨機(jī)分為L(zhǎng)PS刺激量效組和時(shí)效組：量效組分別以0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml LPS與RPMVEC孵育6h，時(shí)效組以10μg/ml LPS與RPMVEC分別孵育1h、2h、3h、6h，以上均設(shè)置相應(yīng)對(duì)照組； RPMVEC與PKC抑制劑雙吲哚基順丁烯二酰亞胺（bis-indolylmaleimide, BIM）預(yù)孵育1h，再與10μg/ml的LPS繼續(xù)孵育6h，以上設(shè)置相應(yīng)對(duì)照組；原位雜交（In situ hybridization, ISH）與JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)不同條件下RPMVEC中Cav-1mRNA的表達(dá)變化。 結(jié)果1.體外成功進(jìn)行RPMVEC的分離、培養(yǎng)，并經(jīng)形態(tài)學(xué)及異硫氰酸標(biāo)記的植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定證實(shí)。2. RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)出RPMVEC中表達(dá)Cav-1基因和蛋白。3. LPS以濃度依賴方式誘導(dǎo)Cav-1mRNA表達(dá)增加：0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml LPS分別孵育RPMVEC6h后，Cav-1mRNA表達(dá)量隨其濃度增加逐漸升高，與正常組比較差異均顯著（P 0.05）；10μg/ml LPS刺激RPMVEC不同時(shí)間（1h、2h、3h、6h）后，RPMVEC中Cav-1mRNA表達(dá)水平呈動(dòng)態(tài)變化：1h開始上升，2h達(dá)峰值，之后逐漸下降，，但至6h仍高于正常水平（P 0.05）。4.10μmol/L BIM預(yù)孵育RPMVEC1h后，可顯著下調(diào)10μg/ml LPS對(duì)Cav-1mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng)（P 0.05）。 結(jié)論1.成功進(jìn)行RPMVEC的分離、培養(yǎng)和鑒定。2. RPMVEC表達(dá)Cav-1。3. LPS以濃度及時(shí)間依賴方式上調(diào)RPMVEC中Cav-1mRNA的表達(dá)。4. PKC抑制劑BIM能夠下調(diào)LPS對(duì)RPMVEC中Cav-1mRNA的誘導(dǎo)效應(yīng)。
[Abstract]:Objective to study the effect of lipopolysaccharide (LPS) on the expression of fossa protein (-1) caveolin-1 (Cav-1) mRNA in rat pulmonary microvascular endothelial cells (RPMVECs), and to observe the effect of protein kinase kinase (kinase) inhibitor on Cav-1mRNA expression induced by LPS. To further study the role and role of Cav-1 in the pathogenesis of acute lung injury/acute respiratory distress syndrome (Ali / ARDS) in patients with acute lung injury / acute respiratory distress syndrome (ARDS). Methods RPMVECs were isolated and cultured in vitro. Reverse transcriptpolymerase chain reactionation (RT-PCRR) was used to detect the expression of Cav-1mRNA and protein in RPMVEC by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunofluorescence. RPMVEC was randomly divided into two groups: 1 渭 g / ml 1 渭 g / ml LPS and 10 渭 g / ml LPS were incubated with RPMVEC for 6 h respectively, and 10 渭 g / ml LPS and RPMVEC were incubated with 10 渭 g / ml LPS for 6 h, respectively. All of them were set up as control group; RPMVEC was incubated with PKC inhibitor diindole maleic maleic acid for 6 h. Bis-indolylmaleimide (bimm) was preincubated for 1 hour and then incubated with 10 渭 g / ml LPS for 6 h. In situ hybridization of in situ (ISH) and JD801 morphological image analysis system were used to detect the expression of Cav-1mRNA in RPMVEC under different conditions. Results 1. RPMVEC was isolated and cultured successfully in vitro. Morphological and isothiocyanate-labeled plant agglutinin binding assay confirmed that the expression of Cav-1 gene and protein in RPMVEC was detected by RT-PCR and immunofluorescence. LPS induced Cav-1mRNA expression to increase 1 渭 g / ml LPS 10 渭 g / ml LPS in a concentration-dependent manner after RPMVEC6h was incubated with 1 渭 g / ml LPS, respectively. The expression of Cav-1 mRNA increased with the increase of its concentration. Compared with the control group, the difference was significant (P 0.05g / ml LPS stimulated RPMVEC at different time (1h / h) / 3h / h / 6h). The expression of Cav-1mRNA in RPMVEC began to rise to its peak at 1: 1 h, and then decreased gradually, but it was still higher than the normal level (P 0.05 .4.10 渭 mol/L BIM) after preincubation of RPMVEC1h at 6 h, and the expression of Cav-1mRNA in RPMVEC was significantly higher than that in the control group (P 0.05. 4. 10 渭 mol/L BIM preincubated at 6 h). The effect of 10 渭 g / ml LPS on Cav-1mRNA expression was significantly down-regulated (P 0.05). The expression of Cav-1.3. LPS up-regulated the expression of Cav-1mRNA in RPMVEC in a dose-and time-dependent manner. PKC inhibitor BIM could down-regulate the inductive effect of LPS on Cav-1mRNA in RPMVEC. 2.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R563.8

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本文編號(hào)：1507036