本文關(guān)鍵詞： 小鼠肺泡巨噬細(xì)胞株 炎癥性肺病 脂多糖 p38絲裂原活 化蛋白激酶 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化因子-3 白介素-10　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：炎癥性肺�。╥nflammatory lung disease, ILD）是感染、中毒、免疫等各種肺內(nèi)外因素引起的肺部炎癥反應(yīng)。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是其重要致病因素。肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophage, AM）作為肺部第一道防線，在啟動和維持炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。LPS作用于AM表面受體，通過細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)傳遞，可釋放促炎因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α和抗炎因子如白介素（Interleukin, IL）-10。P38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase, MAPK）是參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要激酶，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活子-3（signal transducers and activators of transcription-3,STAT3）在LPS導(dǎo)致的炎癥瀑布反應(yīng)中發(fā)揮作用[1]。p38MAPK抑制劑SB203580可抑制LPS所致肺部炎癥反應(yīng)。我們假設(shè)p38MAPK和STAT3信號通路間存在關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)以小鼠AM為研究對象，觀察SB203580對LPS誘導(dǎo)的MH-S細(xì)胞上清液IL-10及STAT3活化的影響，探討p38MAPK與STAT3間關(guān)系，為臨床治療ILD提供新的思路。 方法：（1） ELISA法測定細(xì)胞上清液IL-10濃度：復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)MH-S細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106/ml于24孔板中過夜，隨機(jī)分組刺激后收集細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒檢測IL-10濃度。分組：①對照組：加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的無血清RPMI1640培養(yǎng)液;②LPS組：終濃度100ng/ml LPS;③LPS+SB5組：加入終濃度5μΜ SB203580，20min后加入終濃度100ng/ml LPS;④LPS+SB10組：加入終濃度10μΜSB203580,20min后加入終濃度100ng/ml LPS;⑤LPS+SB15組：加入終濃度15μΜ SB203580，20min后加入終濃度100ng/ml LPS。各組分別刺激90min、2h、4h、6h、12h取細(xì)胞上清液，凍存于-80℃，待ELISA檢測IL-10濃度。（2）免疫細(xì)胞化學(xué)法測定STAT3和磷酸化STAT3的表達(dá)變化。調(diào)整細(xì)胞濃度106/ml，于24孔板爬片過夜，按以下分組分別測定STAT3和磷酸化STAT3的表達(dá)。分組：①對照組：加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的無血清RPMI1640培養(yǎng)液;②LPS15min組：終濃度100ng/ml LPS; ③LPS15min+SB10組：加入終濃度10μΜ SB203580，20min后加入終濃度100ng/ml LPS。 結(jié)果：（1）ELISA測定細(xì)胞上清液中IL-10含量的變化：LPS刺激MH-S細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中IL-10含量增加，LPS刺激90min，，IL-10含量開始升高，6h達(dá)最高值，12h含量降低。經(jīng)單因素方差分析，對照組、LPS組與SB+LPS組，三組間IL-10表達(dá)水平有顯著性差異（P0.05）。SB203580（5μΜ、10μΜ和15μΜ）預(yù)處理顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-10含量增加，SB203580組無顯著量效關(guān)系（P＞0.05），IL-10含量仍高于對照組。（2）免疫細(xì)胞化學(xué)測定STAT3和磷酸化STAT3的表達(dá)變化。①STAT3的表達(dá)變化：對照組及試驗(yàn)組均細(xì)胞質(zhì)黃染，經(jīng)單因素方差分析，各組間STAT3表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;②磷酸化STAT3的表達(dá)變化：對照組僅見微弱黃染，LPS15min組細(xì)胞核黃染增強(qiáng)，LPS15min+SB10組細(xì)胞核黃染變淡。經(jīng)單因素方差分析，兩個實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，磷酸化STAT3表達(dá)均顯著增高（P0.05）；與LPS15min組比較，LPS15min+SB10組磷酸化STAT表達(dá)顯著降低（P0.05），但與對照組比較LPS15min+SB10組磷酸化STAT3表達(dá)仍顯著增高（P0.05）。 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。各組用單因素方差分析（One wayANOVA）進(jìn)行比較。如有顯著性用Student-Newman-Keuls（SNK-q）檢驗(yàn)，P0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：1LPS刺激MH-S細(xì)胞引起細(xì)胞上清中IL-10分泌增加；用p38MAPK抑制劑SB203580干預(yù)后，IL-10的分泌減少，仍高于對照組，提示SB203580可能抑制IL-10分泌。隨著SB203580劑量增加，IL-10含量差異不顯著，提示SB203580劑量增加可能對抗炎細(xì)胞因子IL-10無顯著性影響。2非活性STAT3存在于細(xì)胞漿。LPS刺激MH-S細(xì)胞后，STAT3被激活變?yōu)橛谢钚缘膒-STAT3，部分從細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核。應(yīng)用SB203580干預(yù)后，細(xì)胞核黃染減弱，說明SB203580可能通過p38MAPK減少p-STAT3的表達(dá)，提示p38MAPK和STAT3間可能存在關(guān)聯(lián)。3上述結(jié)果提示SB203580可能通過p38MAPK抑制STAT3活化，從而抑制IL-10分泌。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R563.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1504375