發(fā)布時(shí)間：2017-12-13 16:37

  本文關(guān)鍵詞：脂多糖誘導(dǎo)髓源抑制性細(xì)胞對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥影響研究

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【摘要】：研究背景 支氣管哮喘,是世界范圍內(nèi)常見的疾病之一,是變應(yīng)原誘發(fā)的以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和可逆性氣流受阻為特征的一種慢性呼吸道疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全世界每年約有1500萬(wàn)人因哮喘失去勞動(dòng)能力,患者及社會(huì)為控制哮喘付出了巨大的費(fèi)用,給社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,對(duì)于哮喘的發(fā)病機(jī)制及其防治的研究,是國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。 哮喘的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚,其本質(zhì)是與免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌及遺傳等多種因素都密切相關(guān)的一種氣道慢性炎癥。目前,獲得性免疫反應(yīng)機(jī)制在哮喘發(fā)病中的重要作用已被為多數(shù)學(xué)者所接受,與其相關(guān)研究也已經(jīng)比較成熟。經(jīng)典的哮喘發(fā)病理論認(rèn)為機(jī)體接觸過敏原后,通過抗原呈遞細(xì)胞,將免疫信號(hào)傳遞給輔助性T淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞),使得輔助性T細(xì)胞0(Th0細(xì)胞)向輔助性T細(xì)胞2(Th2細(xì)胞)分化,導(dǎo)致白介素4(Interleukin, IL-4)等相關(guān)因子分泌增多,從而導(dǎo)致Thl/Th2細(xì)胞比例失衡。Th2細(xì)胞過度活化可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分泌多種炎癥因子,刺激嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞成熟,進(jìn)一步刺激多種炎癥介質(zhì)產(chǎn)生,從而導(dǎo)致氣道炎癥的發(fā)生。但是,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致Thl/Th2細(xì)胞比例失衡的另一個(gè)重要原因是由于哮喘患者自身對(duì)過敏原存在免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的缺陷,使得固有免疫系統(tǒng)在哮喘發(fā)病中的作用地位受到了重視。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是固有免疫組成細(xì)胞之一,它能夠通過多種機(jī)制誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)自身抗原和過敏原產(chǎn)生免疫耐受,尤其是CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞作用最為明顯。有研究發(fā)現(xiàn),重癥哮喘患者體內(nèi)Treg細(xì)胞的表達(dá)減弱,通過卡介苗能夠上調(diào)哮喘大鼠模型外周血和淋巴液中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量,增強(qiáng)免疫抑制效應(yīng),從而發(fā)揮抑制氣道炎癥的作用。血紅素加氧酶也被證實(shí)可以通過誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá),激活CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞,以拮抗哮喘氣道炎癥。 髓源抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived Suppressor Cell, MDSCs)主要是處于分化早期的一群異質(zhì)性的髓系細(xì)胞,其對(duì)固有免疫和獲得性免疫均具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力。在病理環(huán)境下,髓源抑制性細(xì)胞可以通過精氨酸酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶激活發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)該群細(xì)胞除了通過髓樣分化基因88(Myeloid differentiation primary response gene, MyD88)和Toll樣受體7(Toll like receptor,TLR7)途徑調(diào)節(jié)體內(nèi)T輔助細(xì)胞的分化,還可以通過分泌IL-10調(diào)節(jié)Thl/Th2細(xì)胞平衡。近年來(lái),研究還證實(shí)該群細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞產(chǎn)生,從而對(duì)機(jī)體的固有免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。該群細(xì)胞最早發(fā)現(xiàn)于腫瘤患者體內(nèi),對(duì)腫瘤的免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用,為了確定這樣一群異質(zhì)性細(xì)胞,到目前為止,已經(jīng)進(jìn)行了10種不同腫瘤模型的研究,每種模型中髓源抑制性細(xì)胞數(shù)量均較對(duì)照組模型顯著增加,而且不同模型中還存很多差異。在小鼠體內(nèi),髓源抑制性細(xì)胞的表面標(biāo)志通常為CD11b和Gr-1,Gr-1還可進(jìn)一步分為L(zhǎng)y6G和Ly6C。因?yàn)樾∈笃废岛图膊☆愋偷牟煌?有些髓源抑制性細(xì)胞僅表達(dá)CD11b或Gr-1。在早期的研究中,依據(jù)髓源抑制性細(xì)胞表面標(biāo)志物的不同,主要將其劃分為表達(dá)CD11b+Ly6G+Ly6Clow的粒細(xì)胞型和CD11b+Ly6G-Ly6Chigh的單核細(xì)胞型。隨后的研究發(fā)現(xiàn)這兩種亞型的髓源抑制性細(xì)胞在腫瘤、感染以及自身免疫性疾病的作用和機(jī)制都是不同的。單核細(xì)胞型髓源抑制性細(xì)胞主要通過一氧化氮(Nitric oxide, NO)抑制T細(xì)胞增殖,而粒細(xì)胞型髓源抑制性細(xì)胞產(chǎn)生NO的水平較低,不能抑制T細(xì)胞增殖。隨著研究的不斷深入,對(duì)于髓源抑制性細(xì)胞亞型的鑒定也成為可能,并發(fā)現(xiàn)了CD11b+Ly6G-Ly6C-、CD11b+Ly6G+Ly6C+、CD11b+Ly6G-Ly6+CD11b+Ly6G+Ly6C-等許多新的亞型,但這些亞型對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的具體調(diào)節(jié)作用仍然未完全明確。 脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS),也被稱為內(nèi)毒素,是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要組成成分之一,作為具有高度保守結(jié)構(gòu)的病原相關(guān)分子模式,在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)中充當(dāng)TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的配體,該配體被識(shí)別后遷移至外周,導(dǎo)致未成熟髓樣細(xì)胞分化成熟受阻,從而誘導(dǎo)髓源抑制性細(xì)胞的產(chǎn)生。我們前期的研究中已經(jīng)證實(shí)通過腹腔注射脂多糖的方法可以誘導(dǎo)CD11b+Gr-1+髓源抑制性細(xì)胞產(chǎn)生,并發(fā)現(xiàn)將脂多糖誘導(dǎo)的髓源抑制性細(xì)胞由尾靜脈過繼轉(zhuǎn)移至哮喘小鼠體內(nèi),對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥具有明顯的緩解作用。但是,由于當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)間周期較短的限制,未能進(jìn)一步觀察其它亞型髓源抑制性細(xì)胞對(duì)哮喘氣道炎癥的影響。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察脂多糖對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑的不同影響,進(jìn)一步觀察脂多糖干預(yù)后哮喘小鼠體內(nèi)髓源抑制性細(xì)胞各亞型變化,并通過檢測(cè)哮喘小鼠外周Th1/Th2細(xì)胞比例,CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞,肺組織內(nèi)iNOS表達(dá)及肺泡灌洗液中NO的含量,探討不同亞型髓源抑制性細(xì)胞影響哮喘的可能機(jī)制。 第一部分脂多糖對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑的影響 目的：探討不同濃度大腸埃希桿菌脂多糖在哮喘小鼠造模不同時(shí)期影響哮喘氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑的機(jī)制。 方法：SPF級(jí)BALB/c小鼠48只,隨機(jī)分為哮喘組、對(duì)照組、LPS組(致敏前組,包括l00ng組和l0μg組；誘發(fā)前組,包括100ng組和l0μg組；誘發(fā)后組,包括100ng組和10μg組),每組6只。哮喘組和LPS組予以卵蛋白溶液致敏和誘發(fā)建立哮喘模型,對(duì)照組采用生理鹽水代替。LPS組在致敏前、誘發(fā)前和誘發(fā)后分別予100ng或10μg脂多糖腹腔注射。造模結(jié)束后,用無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)氣道反應(yīng)性(Penh值)的變化。觀察肺組織病理改變并運(yùn)用MGE.J圖象分析軟件評(píng)估氣道重塑；計(jì)數(shù)肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞(N%)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS%)、淋巴細(xì)胞百分比；免疫組化觀察肺組織內(nèi)iNOS表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)(ELISA)肺泡灌洗液中IL-4、NO含量評(píng)估氣道炎癥。 結(jié)果：1.無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)：Penh值結(jié)果顯示,從基線值到乙酰甲膽堿濃度為3.125mg/ml時(shí),正常對(duì)照組、哮喘組、LPS組Penh值無(wú)明顯差異(均P0.05)。從6.25mg/ml濃度開始,與哮喘組比較,對(duì)照組、100ng致敏前組、10gg致敏前組、100ng誘發(fā)后組以及10μg誘發(fā)后組Penh值明顯下降(P0.05),而100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組Penh值無(wú)顯著差異(P0.05)；與對(duì)照組比較,LPS各組Penh值升高(P0.05)；LPS各濃度間比較,同一時(shí)間段不同濃度兩組間比較無(wú)顯著差異(P0.05)。 2.BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)：哮喘組小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞總數(shù)以及中性粒細(xì)胞百分比(N%)、嗜酸性粒細(xì)胞百分(E%)比與對(duì)照組比較明顯增多(P0.05)。與哮喘組比較,100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組炎癥細(xì)胞總數(shù)以及N%、E%明顯降低(P0.05),但較對(duì)照組仍有升高(P0.05),三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而10μg致敏前組、誘發(fā)前組100ng和10gg誘發(fā)前組炎癥細(xì)胞總數(shù)以及N%均較哮喘組增高(P0.05),E%無(wú)明顯差異(P0.05),三組間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；對(duì)照組、哮喘組、LPS各組間淋巴細(xì)胞百分百均無(wú)明顯差異(均P0.05)。 3.肺組織病理學(xué)變化：對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,基本無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；哮喘組小鼠支氣管周圍有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加,上皮損傷,細(xì)胞排列紊亂；100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組病理組織改變均較哮喘組減輕,而10μg致敏前組、100ng誘發(fā)后組、10μg誘發(fā)后組和哮喘組無(wú)明顯差異。 4.氣道重塑評(píng)估：哮喘組、LPS組比對(duì)照組氣道重塑加重(P0.05)。與哮喘組比較,100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組氣道重塑顯著減輕(P0.05)；而10μg致敏前組、100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組較哮喘組加重(P0.05)；100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組組間比較,10μg致敏前組、100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組組間比較均無(wú)明顯差異(P0.05)。 5免疫組化法檢測(cè)肺組織內(nèi)iNOS表達(dá)：本研究結(jié)果顯示iNOS表達(dá)在哮喘組小鼠肺組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性,而對(duì)照組和LPS各組小鼠肺組織內(nèi)iNOS未見明顯表達(dá)。 6.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)吸附法檢測(cè)肺泡灌洗液中NO的含量：哮喘組BALF中NO的含量(9.19±2.54)較對(duì)照組(0.67±0.14)顯著增高(P0.05)；而LPS干預(yù)的各組小鼠肺泡灌洗液中未檢測(cè)到NO表達(dá)。 7. BALF中IL-4含量：與對(duì)照組相比,哮喘組以及BALF中IL-4水平升高(P0.05)；與哮喘組相比,100ng誘發(fā)前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組明顯降低(P0.05)；而10μg致敏前組、100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組較哮喘組無(wú)明顯差異(P0.05)；100ng誘發(fā)前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組組間比較,10μg致敏前組、100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組組間比較均無(wú)明顯差異(P0.05)。 結(jié)論：1.早期和晚期脂多糖干預(yù)可緩解哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性。 2.早期低劑量(致敏前100ng)和晚期(誘發(fā)后100ng或10μg)脂多糖干預(yù)可通過下調(diào)肺組織內(nèi)iNOS表達(dá),緩解哮喘氣道炎癥和氣道重塑。 3.早期高劑量(致敏前10μg)和誘發(fā)階段(致敏前100ng或10μg)脂多糖將加重氣道炎癥和氣道重塑。 第二部分脂多糖誘導(dǎo)髓源抑制性細(xì)胞各亞型差異及對(duì)哮喘氣道影響 目的：探討不同濃度脂多糖對(duì)哮喘小鼠脾臟髓源抑制性細(xì)胞各亞型的誘導(dǎo)及其對(duì)哮喘的影響。 方法：具體同第一部分。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中髓源抑制性細(xì)胞各亞型比例,以及外周血中Thl/Th2細(xì)胞比例和CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞。 結(jié)果：1.脂多糖誘導(dǎo)脾臟中髓源抑制性細(xì)胞亞型的變化：哮喘組和對(duì)照組間比較,Ly6G+Ly6C-、Ly6G-Ly6C-、Ly6G-Ly6C+占CDllb+MDSC比例明顯增高,Ly6G+Ly6C+匕例降低(均P0.05)。與哮喘組比較,100ng誘發(fā)前組或10μg誘發(fā)前組Ly6G+Ly6C-、Ly6G-Ly6C-、Ly6G-Ly6C+增加(均P0.05),Ly6G+Ly6C+無(wú)差異(P0.05)；100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10gg誘發(fā)后Ly6G+Ly6C-、 Ly6G-Ly6C-、Ly6G-Ly6C+降低(均P0.05),Ly6G+Ly6C+增加(P0.05)；10μg致敏前組Ly6G-Ly6C-、Ly6G-Ly6C+降低,Ly6G+Ly6C+增加(均P0.05),Ly6G+Ly6C-無(wú)明顯差異(P0.05)。不同時(shí)間段的兩組間比較,除致敏前10gg脂多糖干預(yù)組Ly6G+Ly6C-,其余各組組間均無(wú)明顯差異(P0.05)。 2.外周血Thl/Th2細(xì)胞檢測(cè)：哮喘小鼠外周血中Thl/Th2與正常小鼠比較存在顯著性偏移(P0.05)。與哮喘組比較,100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組則Thl/Th2均增大(P0.05),而10μg致敏前組、100ng誘發(fā)前組或10ug誘發(fā)前組Thl/Th2差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與對(duì)照比較,100ng誘發(fā)后組和10gg誘發(fā)后組Thl/Th2均增大(P0.05),而10gg致敏前組、100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組Th1/Th2均減小(P0.05),100ng誘發(fā)前組無(wú)明顯差異(P0.05)；不同時(shí)間段的兩組間比較,除10μg致敏前組,其余各組組間均無(wú)明顯差異(P0.05)。 3.外周血Treg細(xì)胞檢測(cè)：哮喘小鼠外周血中Treg細(xì)胞較正常小鼠降低(P0.05)。與哮喘組比較,100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+陽(yáng)性比例均增加(P0.05),10μg致敏前組、100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組均無(wú)顯著差異(P0.05)；與對(duì)照組比較,100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后和10μg誘發(fā)后預(yù)組CD4+CD25+Treg、 CD4+CD25+Foxp3+Treg匕例均增加,10gg致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10gg誘發(fā)后組比例均降低(均P0.05)。不同時(shí)間段的兩組間比較,均無(wú)明顯差異(P0.05)。 結(jié)論：1.早期低劑量(致敏前100ng)和晚期(誘發(fā)后100ng或10μg)脂多糖可刺激CD11b+Ly6G+Ly6C+亞型分化,緩解哮喘小鼠氣道炎癥。 2.早期高劑量(致敏前10μg)和誘發(fā)階段(誘發(fā)前100ng或1Oμg)脂多糖可刺激CD11b+Ly6G-Ly6C-、CD11b+Ly6G+Ly6C-、CD11b+Ly6G-Ly6C+亞型分化加重哮喘小鼠氣道炎癥。 3.脂多糖誘導(dǎo)髓源抑制性細(xì)胞亞型變化,可能是調(diào)節(jié)哮喘固有免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 施宇衡;時(shí)國(guó)朝;萬(wàn)歡英;蔣黎華;艾香艷;朱海星;湯葳;;支氣管哮喘患者外周血Th17、CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞表達(dá)特征[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2010年08期

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本文編號(hào)：1285856