本文關鍵詞：脂多糖誘導髓源抑制性細胞對哮喘小鼠氣道炎癥影響研究

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【摘要】：研究背景 支氣管哮喘,是世界范圍內(nèi)常見的疾病之一,是變應原誘發(fā)的以氣道炎癥、氣道高反應性和可逆性氣流受阻為特征的一種慢性呼吸道疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全世界每年約有1500萬人因哮喘失去勞動能力,患者及社會為控制哮喘付出了巨大的費用,給社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。因此,對于哮喘的發(fā)病機制及其防治的研究,是國內(nèi)外醫(yī)學界關注的熱點。 哮喘的發(fā)病機制至今尚未完全清楚,其本質(zhì)是與免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌及遺傳等多種因素都密切相關的一種氣道慢性炎癥。目前,獲得性免疫反應機制在哮喘發(fā)病中的重要作用已被為多數(shù)學者所接受,與其相關研究也已經(jīng)比較成熟。經(jīng)典的哮喘發(fā)病理論認為機體接觸過敏原后,通過抗原呈遞細胞,將免疫信號傳遞給輔助性T淋巴細胞(Th細胞),使得輔助性T細胞0(Th0細胞)向輔助性T細胞2(Th2細胞)分化,導致白介素4(Interleukin, IL-4)等相關因子分泌增多,從而導致Thl/Th2細胞比例失衡。Th2細胞過度活化可以促進B淋巴細胞分泌多種炎癥因子,刺激嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞等炎癥細胞成熟,進一步刺激多種炎癥介質(zhì)產(chǎn)生,從而導致氣道炎癥的發(fā)生。但是,近年來研究發(fā)現(xiàn)導致Thl/Th2細胞比例失衡的另一個重要原因是由于哮喘患者自身對過敏原存在免疫調(diào)節(jié)機制的缺陷,使得固有免疫系統(tǒng)在哮喘發(fā)病中的作用地位受到了重視。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)是固有免疫組成細胞之一,它能夠通過多種機制誘導機體對自身抗原和過敏原產(chǎn)生免疫耐受,尤其是CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞作用最為明顯。有研究發(fā)現(xiàn),重癥哮喘患者體內(nèi)Treg細胞的表達減弱,通過卡介苗能夠上調(diào)哮喘大鼠模型外周血和淋巴液中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞數(shù)量,增強免疫抑制效應,從而發(fā)揮抑制氣道炎癥的作用。血紅素加氧酶也被證實可以通過誘導CD4+CD25+Treg細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達,激活CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞,以拮抗哮喘氣道炎癥。 髓源抑制性細胞(Myeloid-derived Suppressor Cell, MDSCs)主要是處于分化早期的一群異質(zhì)性的髓系細胞,其對固有免疫和獲得性免疫均具有較強的調(diào)節(jié)能力。在病理環(huán)境下,髓源抑制性細胞可以通過精氨酸酶和誘導型一氧化氮合酶激活發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)該群細胞除了通過髓樣分化基因88(Myeloid differentiation primary response gene, MyD88)和Toll樣受體7(Toll like receptor,TLR7)途徑調(diào)節(jié)體內(nèi)T輔助細胞的分化,還可以通過分泌IL-10調(diào)節(jié)Thl/Th2細胞平衡。近年來,研究還證實該群細胞可以通過誘導CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞產(chǎn)生,從而對機體的固有免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。該群細胞最早發(fā)現(xiàn)于腫瘤患者體內(nèi),對腫瘤的免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用,為了確定這樣一群異質(zhì)性細胞,到目前為止,已經(jīng)進行了10種不同腫瘤模型的研究,每種模型中髓源抑制性細胞數(shù)量均較對照組模型顯著增加,而且不同模型中還存很多差異。在小鼠體內(nèi),髓源抑制性細胞的表面標志通常為CD11b和Gr-1,Gr-1還可進一步分為Ly6G和Ly6C。因為小鼠品系和疾病類型的不同,有些髓源抑制性細胞僅表達CD11b或Gr-1。在早期的研究中,依據(jù)髓源抑制性細胞表面標志物的不同,主要將其劃分為表達CD11b+Ly6G+Ly6Clow的粒細胞型和CD11b+Ly6G-Ly6Chigh的單核細胞型。隨后的研究發(fā)現(xiàn)這兩種亞型的髓源抑制性細胞在腫瘤、感染以及自身免疫性疾病的作用和機制都是不同的。單核細胞型髓源抑制性細胞主要通過一氧化氮(Nitric oxide, NO)抑制T細胞增殖,而粒細胞型髓源抑制性細胞產(chǎn)生NO的水平較低,不能抑制T細胞增殖。隨著研究的不斷深入,對于髓源抑制性細胞亞型的鑒定也成為可能,并發(fā)現(xiàn)了CD11b+Ly6G-Ly6C-、CD11b+Ly6G+Ly6C+、CD11b+Ly6G-Ly6+CD11b+Ly6G+Ly6C-等許多新的亞型,但這些亞型對機體免疫系統(tǒng)的具體調(diào)節(jié)作用仍然未完全明確。 脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS),也被稱為內(nèi)毒素,是革蘭陰性細菌細胞壁的主要組成成分之一,作為具有高度保守結(jié)構(gòu)的病原相關分子模式,在細胞內(nèi)信號傳導中充當TLRs信號轉(zhuǎn)導分子的配體,該配體被識別后遷移至外周,導致未成熟髓樣細胞分化成熟受阻,從而誘導髓源抑制性細胞的產(chǎn)生。我們前期的研究中已經(jīng)證實通過腹腔注射脂多糖的方法可以誘導CD11b+Gr-1+髓源抑制性細胞產(chǎn)生,并發(fā)現(xiàn)將脂多糖誘導的髓源抑制性細胞由尾靜脈過繼轉(zhuǎn)移至哮喘小鼠體內(nèi),對哮喘小鼠氣道炎癥具有明顯的緩解作用。但是,由于當時實驗時間周期較短的限制,未能進一步觀察其它亞型髓源抑制性細胞對哮喘氣道炎癥的影響。本實驗擬通過觀察脂多糖對哮喘小鼠氣道炎癥、氣道高反應性及氣道重塑的不同影響,進一步觀察脂多糖干預后哮喘小鼠體內(nèi)髓源抑制性細胞各亞型變化,并通過檢測哮喘小鼠外周Th1/Th2細胞比例,CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞,肺組織內(nèi)iNOS表達及肺泡灌洗液中NO的含量,探討不同亞型髓源抑制性細胞影響哮喘的可能機制。 第一部分脂多糖對哮喘小鼠氣道炎癥、氣道高反應性及氣道重塑的影響 目的：探討不同濃度大腸埃希桿菌脂多糖在哮喘小鼠造模不同時期影響哮喘氣道炎癥、氣道高反應性及氣道重塑的機制。 方法：SPF級BALB/c小鼠48只,隨機分為哮喘組、對照組、LPS組(致敏前組,包括l00ng組和l0μg組；誘發(fā)前組,包括100ng組和l0μg組；誘發(fā)后組,包括100ng組和10μg組),每組6只。哮喘組和LPS組予以卵蛋白溶液致敏和誘發(fā)建立哮喘模型,對照組采用生理鹽水代替。LPS組在致敏前、誘發(fā)前和誘發(fā)后分別予100ng或10μg脂多糖腹腔注射。造模結(jié)束后,用無創(chuàng)肺功能檢測氣道反應性(Penh值)的變化。觀察肺組織病理改變并運用MGE.J圖象分析軟件評估氣道重塑；計數(shù)肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細胞總數(shù)及中性粒細胞(N%)、嗜酸性粒細胞(EOS%)、淋巴細胞百分比；免疫組化觀察肺組織內(nèi)iNOS表達；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(ELISA)肺泡灌洗液中IL-4、NO含量評估氣道炎癥。 結(jié)果：1.無創(chuàng)肺功能檢測：Penh值結(jié)果顯示,從基線值到乙酰甲膽堿濃度為3.125mg/ml時,正常對照組、哮喘組、LPS組Penh值無明顯差異(均P0.05)。從6.25mg/ml濃度開始,與哮喘組比較,對照組、100ng致敏前組、10gg致敏前組、100ng誘發(fā)后組以及10μg誘發(fā)后組Penh值明顯下降(P0.05),而100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組Penh值無顯著差異(P0.05)；與對照組比較,LPS各組Penh值升高(P0.05)；LPS各濃度間比較,同一時間段不同濃度兩組間比較無顯著差異(P0.05)。 2.BALF中細胞計數(shù)：哮喘組小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)以及中性粒細胞百分比(N%)、嗜酸性粒細胞百分(E%)比與對照組比較明顯增多(P0.05)。與哮喘組比較,100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組炎癥細胞總數(shù)以及N%、E%明顯降低(P0.05),但較對照組仍有升高(P0.05),三組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；而10μg致敏前組、誘發(fā)前組100ng和10gg誘發(fā)前組炎癥細胞總數(shù)以及N%均較哮喘組增高(P0.05),E%無明顯差異(P0.05),三組間差異亦無統(tǒng)計學意義(P0.05)；對照組、哮喘組、LPS各組間淋巴細胞百分百均無明顯差異(均P0.05)。 3.肺組織病理學變化：對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,基本無炎癥細胞浸潤；哮喘組小鼠支氣管周圍有炎癥細胞浸潤增加,上皮損傷,細胞排列紊亂；100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組病理組織改變均較哮喘組減輕,而10μg致敏前組、100ng誘發(fā)后組、10μg誘發(fā)后組和哮喘組無明顯差異。 4.氣道重塑評估：哮喘組、LPS組比對照組氣道重塑加重(P0.05)。與哮喘組比較,100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組氣道重塑顯著減輕(P0.05)；而10μg致敏前組、100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組較哮喘組加重(P0.05)；100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組組間比較,10μg致敏前組、100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組組間比較均無明顯差異(P0.05)。 5免疫組化法檢測肺組織內(nèi)iNOS表達：本研究結(jié)果顯示iNOS表達在哮喘組小鼠肺組織中呈強陽性,而對照組和LPS各組小鼠肺組織內(nèi)iNOS未見明顯表達。 6.酶聯(lián)免疫斑點吸附法檢測肺泡灌洗液中NO的含量：哮喘組BALF中NO的含量(9.19±2.54)較對照組(0.67±0.14)顯著增高(P0.05)；而LPS干預的各組小鼠肺泡灌洗液中未檢測到NO表達。 7. BALF中IL-4含量：與對照組相比,哮喘組以及BALF中IL-4水平升高(P0.05)；與哮喘組相比,100ng誘發(fā)前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組明顯降低(P0.05)；而10μg致敏前組、100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組較哮喘組無明顯差異(P0.05)；100ng誘發(fā)前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組組間比較,10μg致敏前組、100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組組間比較均無明顯差異(P0.05)。 結(jié)論：1.早期和晚期脂多糖干預可緩解哮喘小鼠氣道高反應性。 2.早期低劑量(致敏前100ng)和晚期(誘發(fā)后100ng或10μg)脂多糖干預可通過下調(diào)肺組織內(nèi)iNOS表達,緩解哮喘氣道炎癥和氣道重塑。 3.早期高劑量(致敏前10μg)和誘發(fā)階段(致敏前100ng或10μg)脂多糖將加重氣道炎癥和氣道重塑。 第二部分脂多糖誘導髓源抑制性細胞各亞型差異及對哮喘氣道影響 目的：探討不同濃度脂多糖對哮喘小鼠脾臟髓源抑制性細胞各亞型的誘導及其對哮喘的影響。 方法：具體同第一部分。用流式細胞術檢測小鼠脾臟中髓源抑制性細胞各亞型比例,以及外周血中Thl/Th2細胞比例和CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞。 結(jié)果：1.脂多糖誘導脾臟中髓源抑制性細胞亞型的變化：哮喘組和對照組間比較,Ly6G+Ly6C-、Ly6G-Ly6C-、Ly6G-Ly6C+占CDllb+MDSC比例明顯增高,Ly6G+Ly6C+匕例降低(均P0.05)。與哮喘組比較,100ng誘發(fā)前組或10μg誘發(fā)前組Ly6G+Ly6C-、Ly6G-Ly6C-、Ly6G-Ly6C+增加(均P0.05),Ly6G+Ly6C+無差異(P0.05)；100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10gg誘發(fā)后Ly6G+Ly6C-、 Ly6G-Ly6C-、Ly6G-Ly6C+降低(均P0.05),Ly6G+Ly6C+增加(P0.05)；10μg致敏前組Ly6G-Ly6C-、Ly6G-Ly6C+降低,Ly6G+Ly6C+增加(均P0.05),Ly6G+Ly6C-無明顯差異(P0.05)。不同時間段的兩組間比較,除致敏前10gg脂多糖干預組Ly6G+Ly6C-,其余各組組間均無明顯差異(P0.05)。 2.外周血Thl/Th2細胞檢測：哮喘小鼠外周血中Thl/Th2與正常小鼠比較存在顯著性偏移(P0.05)。與哮喘組比較,100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組則Thl/Th2均增大(P0.05),而10μg致敏前組、100ng誘發(fā)前組或10ug誘發(fā)前組Thl/Th2差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)；與對照比較,100ng誘發(fā)后組和10gg誘發(fā)后組Thl/Th2均增大(P0.05),而10gg致敏前組、100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組Th1/Th2均減小(P0.05),100ng誘發(fā)前組無明顯差異(P0.05)；不同時間段的兩組間比較,除10μg致敏前組,其余各組組間均無明顯差異(P0.05)。 3.外周血Treg細胞檢測：哮喘小鼠外周血中Treg細胞較正常小鼠降低(P0.05)。與哮喘組比較,100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10μg誘發(fā)后組CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+陽性比例均增加(P0.05),10μg致敏前組、100ng誘發(fā)前組和10μg誘發(fā)前組均無顯著差異(P0.05)；與對照組比較,100ng致敏前組、100ng誘發(fā)后和10μg誘發(fā)后預組CD4+CD25+Treg、 CD4+CD25+Foxp3+Treg匕例均增加,10gg致敏前組、100ng誘發(fā)后組和10gg誘發(fā)后組比例均降低(均P0.05)。不同時間段的兩組間比較,均無明顯差異(P0.05)。 結(jié)論：1.早期低劑量(致敏前100ng)和晚期(誘發(fā)后100ng或10μg)脂多糖可刺激CD11b+Ly6G+Ly6C+亞型分化,緩解哮喘小鼠氣道炎癥。 2.早期高劑量(致敏前10μg)和誘發(fā)階段(誘發(fā)前100ng或1Oμg)脂多糖可刺激CD11b+Ly6G-Ly6C-、CD11b+Ly6G+Ly6C-、CD11b+Ly6G-Ly6C+亞型分化加重哮喘小鼠氣道炎癥。 3.脂多糖誘導髓源抑制性細胞亞型變化,可能是調(diào)節(jié)哮喘固有免疫和獲得性免疫的關鍵環(huán)節(jié)。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

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1 施宇衡;時國朝;萬歡英;蔣黎華;艾香艷;朱海星;湯葳;;支氣管哮喘患者外周血Th17、CD4~+CD25~+Treg細胞表達特征[J];中國免疫學雜志;2010年08期

2 蘇苗賞;李昌崇;葉樂平;鄭吉善;張維溪;羅運春;李孟榮;方周溪;;不同濃度脂多糖對支氣管哮喘大鼠模型建立的影響及調(diào)節(jié)機制[J];中華哮喘雜志(電子版);2007年01期

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本文編號：1285856