本文關(guān)鍵詞：稀土氧化釹致大鼠肺損傷作用機制的實驗研究

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【摘要】：研究目的稀土元素及其化合物由于具有獨特的理化性質(zhì),在多個領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。與此同時,稀土的廣泛應(yīng)用也使稀土元素不可避免地帶來相應(yīng)的毒理學(xué)問題。稀土氧化釹(Nb2O3)為輕稀土氧化物,在工業(yè)上用途廣泛,上世紀(jì)八十年代以后,以金屬釹為原料的新一代磁性材料釹鐵硼問世,并在諸多領(lǐng)域得到應(yīng)用,金屬釹需求劇增。隨著金屬釹應(yīng)用市場的不斷擴大,其生產(chǎn)規(guī)模發(fā)展迅速。作為生產(chǎn)金屬釹的原料氧化釹的用量也必將隨之增加,接觸氧化釹的職業(yè)人群也將增多。大量的職業(yè)人員接觸外源性化學(xué)物稀土氧化釹粉塵,對接觸者究竟會造成什么樣的健康損害特別是對呼吸系統(tǒng)的損傷程度及機制目前還不太清楚。因此,為探究稀土氧化釹的肺損傷作用及機制,為接觸人群的安全暴露和作業(yè)場所職業(yè)接觸限值的制定提供科學(xué)依據(jù),以保障勞動者在工作過程中的安全與健康,推動我國經(jīng)濟發(fā)展和社會文明程度,我們進(jìn)行了本實驗研究。研究方法1.將SD大鼠按體重隨機分為氧化釹染塵組(100mg/kg)和對照組,采用非暴露式氣管內(nèi)灌注法一次性進(jìn)行染毒。分別在染毒后的第3d、7d、14d、 21d、28d五個時間點處死大鼠。2.收集大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF),分析BALF中細(xì)胞成分,測定BALF中總蛋白含量,采用酶聯(lián)免疫法(ELISA法)測定BALF中MCP-1、MIP-1α、 ICAM-1、IL-1β、TNF-α、IL-6的含量。3.收集大鼠肺組織標(biāo)本,取部分標(biāo)本采用HE染色法,染色后通過普通光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變；同時取部分標(biāo)本進(jìn)行天狼猩紅染色,染色后用Nikon Eclipse E800偏振光顯微鏡及Image-Pro Plus Version 4.5 forwindowsTM圖象分析系統(tǒng)分析大鼠肺組織中膠原纖維變化情況。4.提取大鼠肺組織蛋白,采用Western blotting法及非放射性凝膠遷移實驗EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)法測定大鼠肺組織中NF-KBp65、p-NFκBp65、p-IKK beta及NF-κB的表達(dá)。5.培養(yǎng)NR8383細(xì)胞,采用MTT法測定稀土氧化釹對細(xì)胞的毒性作用；采用透射電鏡法及流式細(xì)胞法觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化及凋亡情況；采用酶聯(lián)免疫法(ELISA法)測定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MCP-1、MIP-1α、TGF-β1、IL-1β、TNF-α、IL-8的含量。6.提取染毒后細(xì)胞蛋白,Western blotting法測定細(xì)胞中P-NFκB P65、p-IκKβ和Caspase-3的表達(dá)研究結(jié)果1.實驗大鼠體重及肺臟器系數(shù)變化大鼠染毒后第3、7、14、21和28d體重均低于對照組大鼠體重,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而大鼠肺臟器系數(shù)均高于對照組(P0.05),提示可能是氧化釹粉塵致大鼠肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)致充血、水腫或組織增生。2.染塵大鼠肺組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原面積百分比變化情況與對照組比較,染塵組大鼠各觀察點肺組織Ⅰ型膠原面積百分比均有不同程度的增加,第7天、第14天、第21天和第28天時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。隨著染塵時間的延長,Ⅰ型膠原面積百分比逐漸增加。第28d時,Ⅰ型膠原面積百分比增加了1倍。與對照組比較,染塵組大鼠各觀察時間點肺組織Ⅲ型膠原面積百分比均呈現(xiàn)出不同程度的增加,除了第3d外,其它各組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。隨著染塵時間的延長,大鼠肺組織中Ⅲ型膠原面積百分比呈現(xiàn)增加的趨勢(P0.05)。3.染塵大鼠BALF中細(xì)胞因子水平的測定與對照組相比,氧化釹染塵組大鼠BALF中IL-1和TNF-α的表達(dá)水平顯著增加(P0.05),染塵組大鼠BALF中IL-6表達(dá)水平增加,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與對照組相比,氧化釹染塵組大鼠BALF中炎癥趨化因子(MCP-1, MIP-1α和ICAM-1)的表達(dá)水平呈增高趨勢。MCP-1和MIP-1α僅在第28天時表達(dá)水平顯著增加(P0.05)。4.染塵組大鼠NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)情況氧化釹染塵組,大鼠肺組織內(nèi)P-NF-κB P65蛋白表達(dá)量的增加,而大鼠肺組織內(nèi)NF-κB P65總蛋白水平并沒有發(fā)生變化；在染塵第14天,大鼠肺組織內(nèi)p-IKKβ及P-NF-κB P65的表達(dá)水平達(dá)到高峰,到第28天呈現(xiàn)下降趨勢。對照組中大鼠肺組織內(nèi)P-NF-κB P65, NF-κB P65和p-IKKβ的表達(dá)未觀察到變化。氧化釹染塵組,大鼠肺組織NF-κB P50/P65的核轉(zhuǎn)位被誘導(dǎo),與蛋白印跡法測定的結(jié)果相一致。更重要的是,大鼠肺組織內(nèi)NF-κB P50/P65的遷移在第3天增加,第14天達(dá)高峰,在第21天開始下降。5.稀土氧化釹顆粒物對NR8383細(xì)胞的毒性作用NR8383細(xì)胞經(jīng)稀土氧化釹顆粒物混懸液處理12h、24h、48h后,1.56、3.125、6.25μg/mL染毒組在各時間點的細(xì)胞抑制率與對照組相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；隨著稀土氧化釹顆粒物濃度的增加,細(xì)胞抑制率呈現(xiàn)上升趨勢(R2值分別為0.959、0.948、0.943)；在染毒濃度為50、100、200μg/mL時,不同染毒時間點的細(xì)胞抑制率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.54, P0.05; F=17.596, P0.05; F=9.332, P0.05);稀土氧化釹顆粒物作用于NR8383細(xì)胞,細(xì)胞毒性呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系和時間-效應(yīng)關(guān)系。6.不同濃度稀土氧化釹顆粒物暴露對NR8383細(xì)胞凋亡的影響NR8383細(xì)胞經(jīng)不同濃度稀土氧化釹顆粒物混懸液處理24h后,各染毒組早期凋亡細(xì)胞百分比呈現(xiàn)不同程度的增加,6.25、12.5μg/mL染毒組早期凋亡細(xì)胞百分比與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),12.5μg/mL染毒組早期凋亡細(xì)胞百分比是對照組的7.2倍。在/mL濃度范圍內(nèi),隨著染毒濃度的增加,晚期凋亡細(xì)胞百分比(1.8%、2.4%、2.6%、3.8%、4.1%)逐漸增加,12.5、25、50μg/mL染毒組晚期凋亡細(xì)胞百分比與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。至50μg/mL時,凋亡細(xì)胞百分比開始下降。7.不同濃度稀土氧化釹顆粒物刺激對NR8383細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α、IL-8、 MCP-1、MIP-1α、TGF-β1分泌的影響稀土氧化釹顆粒物刺激NR8383細(xì)胞24h后,染毒組NR8383細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量均高于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),且染毒組細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量隨著染毒劑量的增加呈現(xiàn)增高趨勢(R2值分別為0.986、0.923、0.922、0.990、0.985、0.984),不同染毒組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。8.細(xì)胞毒性與細(xì)胞因子之間的相關(guān)性分析稀土氧化釹顆粒物刺激NR8383細(xì)胞24h后,細(xì)胞抑制率與上清中TNF-α、 IL-1β、IL-8、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量均呈正相關(guān)(P0.01)；且TGF-β1、MIP-1α MCP-1、TNF-α、L-1β及IL-8的含量與細(xì)胞抑制率之間的相關(guān)系數(shù)分別0.912、0.932、0.933、0.935、0.943、0.962。9.NR8383細(xì)胞中Caspase-3、p-NF-κB p65和p-IκKβ的表達(dá)NR8383細(xì)胞給予稀土氧化釹顆粒物刺激24h后,各染毒組細(xì)胞表達(dá)p-NFκBp65、p-IκKβ的量均高于對照組,且濃度為12.5、25、50ug/mL時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；各染毒組細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)量均高于對照組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。10.細(xì)胞因子與NF-κB相關(guān)蛋白之間的相關(guān)性分析稀土氧化釹顆粒物刺激NR8383細(xì)胞24h后, NF-κB相關(guān)蛋白(p-κF-κBP65、 p-IKKβ)與上清中’TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量均呈正相關(guān)；IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量與P-NF-κBP65之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.484、0.359、0.539、0.527、0.535、0.598；；IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-κ MIP-1α及TGF-β1的含量與p-IKKβ之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.326、0.299、0.406、0.397、0.407、0.391。11.細(xì)胞因子與Caspase-3之間的相關(guān)性分析稀土氧化釹顆粒物刺激NR8383細(xì)胞24h后,Caspase-3與上清中TNF-α、 IL-1β、IL-8、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量均呈正相關(guān),IL-1β、IL-8、 TNF-α、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量與Caspase-3之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.177、0.121、0.300、0.258、0.300、0.277。結(jié)論(1)稀土Nd203顆粒物通過非氣管暴露的方式進(jìn)入大鼠肺組織,可致大鼠發(fā)生急性肺組織損傷,早期表現(xiàn)以炎性損傷為主,晚期可形成纖維細(xì)胞性結(jié)衛(wèi)。(2)在稀土氧化釹顆粒物致大鼠急性肺損傷過程中,促炎和抗炎細(xì)胞因子以及蛋白表達(dá)顯著增加,NF-κB由細(xì)胞漿向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移并活化,NF-κB炎性通路被激活,說明NFκkB在稀土氧化釹顆粒物導(dǎo)致肺損傷過程中具有重要作用。(3)培養(yǎng)液上清中的炎性細(xì)胞因子及趨化因子的含量顯著升高,肺泡巨噬細(xì)胞的p-NF-κBP65、p-IKKβ蛋白表達(dá)顯著升高,NF-κB信號通路激活。(4)肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡程度隨著炎性細(xì)胞因子和趨化因子及Caspase-3表達(dá)水平的升高而升高,炎性細(xì)胞因子與Caspase-3呈正相關(guān),TNF-a/TNFR /NF-κB信號通路對肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡可能具有促進(jìn)作用。(5)細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子水平、p-NF-κBP65、p-IKKβ蛋白的表達(dá)水平、肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡水平以及其相互作用關(guān)系,說明NF-κB信號通路激活、肺泡巨噬細(xì)胞凋亡啟動是稀土氧化釹顆粒物致肺損傷的重要機制。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R563

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本文編號：1280143