本文關(guān)鍵詞：氣道平滑肌細(xì)胞中GLP-1受體的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖及炎癥因子的調(diào)節(jié)機(jī)制研究

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【摘要】：背景：慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的可預(yù)防可治療的疾病,其氣流受限多呈進(jìn)行性發(fā)展,通常肺實(shí)質(zhì)和氣道伴有慢性炎癥表現(xiàn)。COPD的致死率和致殘率較高,目前居全球死亡原因的第五位。COPD包括肺氣腫和慢性支氣管炎,但它們有持續(xù)氣道受限才是COPD。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,炎癥反應(yīng)在COPD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用,但是,部分科學(xué)家對(duì)此抱有異議。COPD的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜,目前認(rèn)為COPD的氣道平滑肌增殖及氣道重塑都與炎癥刺激有關(guān)。氣道壁被炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)后,這些炎癥細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞還會(huì)釋放各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)。因此,要想控制炎癥反應(yīng)和延緩氣道重塑,我們可以從氣道平滑肌細(xì)胞入手。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide 1)是由腸道L細(xì)胞所分泌的一種肽類激素,屬于腸促胰液素,有明顯的降糖作用。實(shí)驗(yàn)表明,在阻塞性肺疾病雌性大鼠動(dòng)物試驗(yàn)中,GLP-1有明顯的改善肺功能和降低死亡率的作用。GLP-1通過(guò)與胰島β細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)胰島素生成和分泌的作用。此外,GLP-1還有胰腺外的作用,比如,它可以調(diào)節(jié)飲食行為、控制食欲,抑制胃腸運(yùn)動(dòng)、抑制消化液分泌及心肌保護(hù)作用。GLP-1對(duì)這些不同類型靶細(xì)胞發(fā)揮作用都是通過(guò)GLP-1受體完成的。GLP-1受體在胰島、心臟、大腦、腎臟、胃腸道和肺都有表達(dá)。GLP-1具有抗炎作用,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它可以抑制脂多糖所誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞和大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子的分泌。GLP-1有抗炎作用,因此GLP-1受體的激動(dòng)劑在COPD治療中也有重要作用。雖然已證實(shí)GLP-1受體在慢性阻塞性肺疾病中有作用,但它的作用機(jī)制現(xiàn)在還不十分清楚。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),G蛋白偶聯(lián)受體119可以通過(guò)GLP-1受體途徑增強(qiáng)三磷酸腺苷結(jié)合盒A亞家族成員1(ABCA1)的表達(dá),而且在THP-1源性巨噬細(xì)胞上用siRNA技術(shù)將GLP-1基因沉默,ABCA1的表達(dá)就顯著降低。ABCA1是高度保守的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員,在哺乳動(dòng)物多種組織和細(xì)胞上都有表達(dá)。ABCA1在-些肺疾病中也發(fā)揮很大作用。實(shí)驗(yàn)表明,在卵蛋白所激發(fā)的大鼠氣道炎癥反應(yīng)中,ABCA1在血管內(nèi)皮細(xì)胞上會(huì)出現(xiàn)過(guò)表達(dá)。根據(jù)以上研究進(jìn)展,我們猜測(cè)GLP-1受體在COPD中起重要作用,而ABCA1又與GLP-1受體有關(guān)聯(lián)。為了驗(yàn)證這些想法,我們分離了COPD患者的氣道平滑肌細(xì)胞,并且制作了和GLP-1、ABCA1有關(guān)的細(xì)胞模型,以尋找COPD患者氣道平滑肌上GLP-1受體可能的作用機(jī)制,證明GLP-1受體及ABCA1與氣道平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及炎癥因子分泌有關(guān)系。第一部分GLP-1受體在氣道平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)及其生物學(xué)作用的研究目的：本研究旨在探討GLP-1R在正常人和COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)水平差異,進(jìn)而揭示GLP-1R對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)作用,為COPD疾病探尋新的治療靶點(diǎn)并提供新的理論依據(jù)。方法：以2014年3月至2015年9月期間南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院胸外科肺部手術(shù)患者為研究對(duì)象,正常肺組織取自無(wú)COPD病史的肺良性腫瘤患者,COPD肺組織取自行肺減容術(shù)的患者。COPD的診斷按照2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)公布的慢性阻塞性肺疾病全球倡議(GOLD)科學(xué)委員會(huì)的診斷標(biāo)準(zhǔn),排除任何可能影響COPD病情的因素影響。用RT-PCR方法檢測(cè)正常人和COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞GLP-1受體的mRNA表達(dá)水平差異。用Western blot方法檢驗(yàn)上述兩組氣道平滑肌細(xì)胞GLP-1受體蛋白的表達(dá)水平。應(yīng)用pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染使GLP-1受體過(guò)表達(dá),應(yīng)用GLP-1R siRNA沉默基因使GLP-1受體表達(dá)下降。RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)GLP-1受體過(guò)表達(dá)和沉默后GLP-1受體的表達(dá)水平。用MTT比色法觀察氣道平滑肌細(xì)胞增殖情況,用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移情況,用ELISA方法檢測(cè)不同處理組促炎因子IL-6、IL-8、TNFα和GM-CSF的表達(dá)水平。結(jié)果：1.一般資料：實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均取自于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院胸外科18例肺部手術(shù)患者(年齡：45-67歲),正常肺組織取自8例無(wú)COPD病史的肺良性腫瘤患者,COPD肺組織取自10例行肺減容術(shù)的患者。2.正常組和COPD組GLP-1R的表達(dá)比較：用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)GLP-1受體mRNA和蛋白水平,發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比,COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞中GLP-1的表達(dá)較低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.建立氣道平滑肌細(xì)胞GLP-1受體過(guò)表達(dá)和基因沉默的模型：用pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染使GLP-1受體過(guò)表達(dá),應(yīng)用GLP-1R siRNA沉默基因使GLP-1受體表達(dá)下降。用RT-PCR和Western blotting方法分別測(cè)量轉(zhuǎn)染后GLP-1受體表達(dá)的結(jié)果。pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1對(duì)照組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染組GLP-1受體表達(dá)較高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。SiGLP-1R基因沉默組和SiMock對(duì)照組比較結(jié)果顯示SiGLP-1R基因沉默組GLP-1受體表達(dá)較低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示GLP-1受體過(guò)表達(dá)模型和基因沉默細(xì)胞模型均建立成功。4. COPD患者的各種氣道平滑肌細(xì)胞模型中細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移情況：GLP-1受體過(guò)表達(dá)模型與對(duì)照組比較,細(xì)胞增殖更少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。GLP-1受體沉默細(xì)胞模型與SiMock組比較,細(xì)胞增殖多67%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞增殖結(jié)果基本一致。5.用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)COPD患者的各種氣道平滑肌細(xì)胞模型中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α和GM-CSF的釋放：GLP-1受體過(guò)表達(dá)模型與對(duì)照組比較,炎癥因子釋放更少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。GLP-1受體沉默細(xì)胞模型與SiMock組比較,炎癥因子釋放更多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1.GLP-1受體的表達(dá)在正常人和COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞上有所不同,COPD患者GLP-1R表達(dá)較低,提示GLP-1受體可能參與了COPD的發(fā)生發(fā)展。2.GLP-1受體的過(guò)表達(dá)抑制了氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移,而其基因沉默加速了氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。表明GLP-1受體的過(guò)表達(dá)可以減輕細(xì)胞增殖和遷移,因此它在COPD患者的氣道結(jié)構(gòu)重建中可能起重要作用。3.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明,GLP-1受體的過(guò)表達(dá)可以抑制IL-6、IL-8、TNF-α和GM-CSF這些炎癥因子的釋放,而其基因沉默可以使上述炎癥因子的釋放增加。表明GLP-1受體的過(guò)表達(dá)可以減輕炎癥因子的釋放,因此它在COPD患者的炎癥反應(yīng)中可能起重要作用。第二部分關(guān)于ABCA1信號(hào)通路與GLP-1R關(guān)系的研究目的：研究ABCA1與GLP-1R的關(guān)系,求證GLP-1R/ABCA1信號(hào)通路,探討GLP-1R對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞可能的作用機(jī)制。方法：首先,我們將COPD患者的氣道平滑肌細(xì)胞用pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染使GLP-1受體過(guò)表達(dá),應(yīng)用GLP-1R siRNA沉默基因使GLP-1受體表達(dá)下降。接著用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)ABCA1的基因及蛋白表達(dá)水平。第二步,我們?cè)賹OPD患者的氣道平滑肌細(xì)胞用pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染使GLP-1R過(guò)表達(dá),應(yīng)用ABCA1 siRNA沉默基因使ABCA1表達(dá)下降。然后再用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)ABCA1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。用MTT比色法觀察氣道平滑肌細(xì)胞增殖情況,用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移情況,用ELISA方法檢測(cè)不同處理組促炎因子IL-6、IL-8、TNFα和GM-CSF的表達(dá)水平。結(jié)果：1.GLP-1受體過(guò)表達(dá)和GLP-1受體沉默細(xì)胞模型中ABCA1的表達(dá)比較：用RT-PCR和Western bloting方法測(cè)定pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1對(duì)照組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染組ABCA1表達(dá)較高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。SiGLP-1R基因沉默組和SiMock對(duì)照組比較結(jié)果顯示SiGLP-1R基因沉默組ABCA1表達(dá)較低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2. ABCA1沉默細(xì)胞模型中ABCA1的表達(dá)情況：用RT-PCR方法測(cè)定SiABCA1基因沉默組和SiMock對(duì)照組比較結(jié)果顯示SiABCA1基因沉默組ABCA1表達(dá)較低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示COPD患者支氣管平滑肌細(xì)胞的ABCA1基因沉默細(xì)胞模型建立成功。3. COPD患者的各種氣道平滑肌細(xì)胞模型中細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移情況：pcDNA3.1-GLP-1R組與pcDNA3.1組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R組細(xì)胞增殖、遷移更少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。pcDNA3.1-GLP-1 R+SiMock組與pcDNA3.1組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R+SiMock組細(xì)胞增殖、遷移更少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。pcDNA3.1-GLP-1R+SiABCA1組與pcDNA3.1-GLP-1R組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R+SiABCA1組細(xì)胞增殖、遷移更多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果表明,抑制ABCA1可以阻止COPD患者支氣管平滑肌細(xì)胞上GLP-1受體過(guò)表達(dá)所引起的抑制細(xì)胞增殖、遷移作用。4.用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)COPD患者的各種氣道平滑肌細(xì)胞模型中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α和GM-CSF的釋放：pcDNA3.1-GLP-1R組與pcDNA3.1組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R組的炎癥因子釋放更少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。pcDNA3.1-GLP-1R+SiMock組與pcDNA3.1組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R+SiMock組的炎癥因子釋放更少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。pcDNA3.1-GLP-1R+SiABCA1組與pcDNA3.1-GLP-1R組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R+SiABCAl組的炎癥因子釋放更多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果表明,ABCA1基因沉默還可以阻止GLP-1受體過(guò)表達(dá)對(duì)IL-6、IL-8、 TNF-α和GM-CSF這些炎癥因子的釋放抑制作用。結(jié)論：1.GLP-1受體的過(guò)表達(dá)可以明顯上調(diào)ABCA1的表達(dá),GLP-1受體的沉默也可以抑制ABCA1的表達(dá),說(shuō)明GLP-1受體表達(dá)與ABCA1表達(dá)水平之間有關(guān)系。2. ABCA1基因沉默后可以影響GLP-1受體對(duì)支氣管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移及細(xì)胞因子釋放等作用。說(shuō)明GLP-1受體所介導(dǎo)的抑制細(xì)胞增殖、遷移,抑制炎癥因子釋放等作用都是有賴于ABCA1的表達(dá),這些都證明ABCA1在氣道炎癥反應(yīng)中有重要作用。我們可以認(rèn)為GLP-1R/ABCA1通路可能存在。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R563.9

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本文編號(hào)：1278749