本文關(guān)鍵詞：重癥社區(qū)獲得性肺炎患者外周血樹突細(xì)胞表型變化及其臨床意義

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【摘要】：背景:重癥社區(qū)獲得性肺炎(severe community-acquired pneumonia,SCAP)病死率高、預(yù)后差,導(dǎo)致病人死亡的重要原因是感染,及感染后引起的全身炎癥反應(yīng),繼而引起膿毒癥(sepsis)、嚴(yán)重膿毒癥(severe sepsis)、膿毒癥休克(sepsis shock),引發(fā)多器官功能不全。免疫系統(tǒng)多參與參與其中,所以有關(guān)重癥肺炎免疫學(xué)機(jī)制的研究已引起了國內(nèi)外研究者的極大關(guān)注。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)是人體免功系統(tǒng)的重要組成部分。作為抗原呈遞細(xì)胞,它們啟動并控制針對呼吸道病原體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。此外,它們在先天免疫系統(tǒng)的各種功能,縮小了先天和適應(yīng)性免疫之間的間隙。然而,重癥社區(qū)獲得性肺炎患者的外周血樹突細(xì)胞亞群及其表型的變化及其作用,目前仍不十分明確。目的:通過觀察研究重癥社區(qū)獲得性肺炎患者外周血樹突細(xì)胞表型及其相關(guān)功能分子的變化,分析其與重癥肺炎患者臨床指標(biāo)間的相關(guān)性。此外,通過觀察不同時(shí)間點(diǎn)重癥肺炎模型小鼠脾臟、肺臟樹突細(xì)胞的變化,探討樹突狀細(xì)胞(DCs)亞群及表型在重癥社區(qū)獲得性肺炎早期免疫亢進(jìn)及晚期免疫抑制階段中的變化及其作用。方法:采用流式細(xì)胞術(shù)檢測SCAP患者及健康對照外周血中m DC和p DC的頻數(shù)及細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86和共抑制分子PD-L1的表達(dá)水平,并分析DC頻數(shù)與SCAP患者氧合指數(shù)(Pa O2/Fi O2)、血乳酸(Lac)的相關(guān)性。將72只雄性SPF昆明小鼠隨機(jī)被分成重癥肺炎組(n=36)和健康對照組(n=36),每組再隨機(jī)分成6組(4h組、12h組、1d組、3d組、5d組、7d組),重癥肺炎組、健康對照組每小組均有6只小鼠。通過向氣管內(nèi)注射肺炎克雷伯桿菌的方法,制作重癥肺炎小鼠模型。以等量生理鹽水替代肺炎克雷伯桿菌液按上述時(shí)間注射。按不同時(shí)間點(diǎn)分批處死每組小鼠,摘取小鼠的雙肺和脾臟,按不同組別分別進(jìn)行福爾馬林固定、超低溫凍存、酶消化或勻漿處理。HE染色法檢測重癥肺炎組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠脾臟病理變化,免疫組織化學(xué)法觀察小鼠脾臟組織中CD205、CD86樹突細(xì)胞的分布,流式細(xì)胞術(shù)檢測測定CDllc/CD86標(biāo)記陽性細(xì)胞的表達(dá)率和外周血中T細(xì)胞亞群的變化,應(yīng)用末端脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素化脫氧尿嘧啶缺刻標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)對不同時(shí)間點(diǎn)的重癥肺炎組小鼠脾臟樹突細(xì)胞進(jìn)行凋亡原位檢測。通過ELISA方法測定小鼠們血清中和肺組織勻漿中的TNF-α濃度。采用光鏡觀察小鼠肺組織的大體病理變化,并對其進(jìn)行CD86、CD205免疫組化,CDllc免疫熒光技術(shù)標(biāo)記小鼠肺組織中的DCs。密度梯度離心法分離小鼠肺組織中單個(gè)核細(xì)胞,運(yùn)用MACS磁珠分選小鼠肺組織中單個(gè)核細(xì)胞中的DCs,通過流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)進(jìn)行DCs的鑒定和DCs表面細(xì)胞表型的鑒定。采用ELISA方法測定DCs孵育過的上清液中細(xì)胞因子IL-10的濃度。結(jié)果:(1)SCAP患者外周血中樹突細(xì)胞亞群m DC和p DC相對健康對照組其表達(dá)頻數(shù)明顯下降(患者組分別為0.37±0.19和0.19±0 12,對照組為0.51±0.18和0.29±0.13,P0.05)。(2)重癥肺炎患者外周血m DC頻數(shù)與氧合指數(shù)(Pa O2/Fi O2)、血乳酸(Lac)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5878,P0.0001;r=-0.4628,P=0.003)。(3)SCAP患者外周血中樹突細(xì)胞表面的共刺激分子CD80、CD86相對健康對照組其表達(dá)頻數(shù)下降。相關(guān)共抑制分子PDL1相對健康對照組表達(dá)頻數(shù)升高。(4)正常小鼠脾臟DC含量較少,主要分布在脾臟邊緣區(qū)。實(shí)驗(yàn)4h重癥肺炎小鼠脾臟DC細(xì)胞組顯著增生且功能活躍,CD86+/CDIlc+DC占脾臟單個(gè)核細(xì)胞的比例明顯增加,與正常組比較有極顯著差異(P0.01);CD205細(xì)胞顯著增加,尤以邊緣區(qū)顯著,呈片狀分布,正常對照組比較差異有顯著性(P0.01);CD86細(xì)胞含量顯著增加,以邊緣最豐富,彌漫分布,可見DC s棕黃色陽性染色的胞膜呈樹枝狀向周圍延伸,與正常對照組比較差異有顯著性(P0.01);白髓和紅髓中有散在分布小片狀TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多,呈大片、灶狀或巢狀分布;CD4+T細(xì)胞含量明顯下降,而CD8+T細(xì)胞含量明顯增加,CD4+/CD8+比值降低,與正常對照組比較差異具有顯著性(P均0.05)。(5)重癥肺炎模型小鼠12~24h組CD86+/CDIlc+DC比例略有減少,與正常組比較仍有顯著差異(P0.05);CD205細(xì)胞較4 h組略減少,分布較稀疏,但仍明顯多于正常對照組(P0.05);CD4+T細(xì)胞含量繼續(xù)下降至最低點(diǎn),而CD8+T細(xì)胞含量也減少,CD4+/CD8+比值降低,與正常對照組比較差異具有顯著性(P均0.01)。3~5d組CD86+/CDllc+DC表達(dá)比例接近正常組;CD205細(xì)數(shù)接近正常對照組。(6)重癥肺炎模型小鼠3~5d組脾臟凋亡細(xì)胞較12~24h減少,略多于正常對照組;3-5d CD4+T細(xì)胞含量增加,CD4+/CD8+比值回升,但仍低于正常對照組。(7)重癥肺炎模型小鼠5~7d組脾臟CD86+/CDIlc+DC表達(dá)比例明顯下降,與正常組比較有極顯著差異(P0.01);CD205細(xì)胞含量再次明顯增加,呈片狀彌漫分布,與正常對照組和實(shí)驗(yàn)組3~5d比較差異具有顯著性(P0.05);CD86胞膜和部分胞漿呈深棕色,未見樹枝狀胞膜突起,陽性細(xì)胞含量較3~5d組略增加,但遠(yuǎn)不如4h增加明顯,CD+86細(xì)胞數(shù)與正常對照組和實(shí)驗(yàn)組3~5d比較差異均無顯著性;5~7d凋亡細(xì)胞再次增加,白髓和紅髓中見大量TUNEL標(biāo)記陽性的凋亡細(xì)胞;CD4+T細(xì)胞含量再次減少,而CD8+T細(xì)胞含量明顯增加,CD4+/CD8+比值倒置,與正常對照組比較差異具有顯著性(P均0.01)。(8)重癥肺炎模型模型小鼠3-5d組,肺組織勻漿液和血清TNF-α含量較對照組顯著上升約3-5倍,具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。(9)重癥肺炎小鼠模型3-5d組、5-7d組,DCs孵育上清液中IL-10水平較對照組明顯上升,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P0.05)。(10)重癥肺炎小鼠模型,各組肺組織CDllc+DCs數(shù)量明顯增多,12-24h組CDllc+細(xì)胞突起明顯增多,集中分布在血管旁及肺泡間隔中,5-7d組CDllc+細(xì)胞達(dá)到最高值,但細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊,部分細(xì)胞凋亡。(11)重癥肺炎小鼠模型,CD205陽性細(xì)胞數(shù)在4h組與正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而12-24h組顯著升高,與正常對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),CD205與CD11c比值明顯升高至1:1左右,5-7d組,CD205陽性細(xì)胞數(shù)比較12-24h組顯著下降(P0.05)。(12)重癥肺炎小鼠模型,12-24h組,CD86陽性細(xì)胞顯著升高,與正常對照組和5-7d組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。CD86陽性細(xì)胞在5-7d較12-24h組明顯下降,差異具有顯著意義(P0.05)。結(jié)論:(1)重癥社區(qū)獲得性肺炎患者外周血樹突細(xì)胞亞群明顯減低。DCs表面共刺激分子CD80、CD86表達(dá)較健康對照組明顯下降,提示SCAP患者外周血樹突細(xì)胞處于未成熟狀態(tài),導(dǎo)致此類患者抗原呈遞功能下降,免疫應(yīng)答能力不足,機(jī)體抗感染能力降低。DCs表面共抑制分子PD-L1表達(dá)增加,表明SCAP患者存在免疫抑制,是導(dǎo)致其感染控制不佳,甚至發(fā)生繼發(fā)感染的重要原因。(2)重癥肺炎小鼠脾臟DCs經(jīng)歷了由早期免疫增強(qiáng)到晚期免疫抑制的演變過程,感染后早期脾臟樹突狀細(xì)胞免疫活化和晚期的免疫抑制與SCAP病情密切相關(guān)。(3)重癥肺炎小鼠早期,肺間質(zhì)DCs大量募集、活化,進(jìn)而導(dǎo)致免疫反應(yīng)亢進(jìn),炎癥反應(yīng)失調(diào)。重癥肺炎小鼠晚期,肺間質(zhì)DCs活性減低(表達(dá)CD205和CD86比例下降),通過分泌大量負(fù)反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-10,誘導(dǎo)并促進(jìn)了免疫抑制階段的發(fā)生、發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R563.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1251591