本文關(guān)鍵詞：Nogo-B在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用及其機(jī)制初探

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【摘要】：背景:急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)的危重癥之一,微生物感染、外傷、毒氣、污染物、自身抗體、胃酸、栓塞和自由脂肪酸等多種生物、物理和化學(xué)因素均可導(dǎo)致ALI。盡管在過(guò)去幾十年中人們對(duì)ALI的認(rèn)識(shí)不斷加深,在治療上也取得了重大進(jìn)步,但ALI的死亡率(約27%到45%不等)仍居高不下,且ALI的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制也尚無(wú)定論。鑒于當(dāng)前臨床上ALI患者面臨著高死亡率、低治愈率和差的生活質(zhì)量的現(xiàn)實(shí),探明ALI的病理生理機(jī)制從而找到有效的治療措施迫在眉睫。肺泡巨噬細(xì)胞(Alveolar Macrophages,AM)作為肺部主要的固有免疫細(xì)胞,在ALI的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。眾所周知,巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要成分之一,參與了各種炎癥的固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,此外,在損傷修復(fù)、組織重構(gòu)及纖維化等過(guò)程中也起著重要作用。Nogo-B是網(wǎng)狀蛋白家族(reticulon super-family proteins,RTNs)中的成員,因參與了多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程,近來(lái)成為了國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn),研究發(fā)現(xiàn)Nogo-B可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的募集,調(diào)控巨噬細(xì)胞遷移、粘附、吞噬、炎癥因子分泌及殺傷作用等生物學(xué)功能,同時(shí)內(nèi)源性的Nogo-B還可能與巨噬細(xì)胞的活化和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。然而,在ALI狀態(tài)下,Nogo-B是如何調(diào)控巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答目前尚不明確。我們?cè)谇捌诘难芯恐杏^察到ALI小鼠的肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)細(xì)胞中,肺氣道、血管及肺泡上皮組織中Nogo-B的表達(dá)水平均較正常小鼠降低,以BALF細(xì)胞降低最為顯著,而B(niǎo)ALF中的細(xì)胞成分主要為AM。因此,我們推測(cè)Nogo-B對(duì)AM的功能發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。為了證實(shí)上述推論并初步闡明其分子機(jī)制,本研究選用小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7為研究對(duì)象,在LPS刺激下研究Nogo-B對(duì)巨噬細(xì)胞分泌、遷移、抗原提呈等免疫應(yīng)答過(guò)程的影響并初步探討其機(jī)制。方法:一、選擇小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象,加入胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃,5%CO_2濃度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。用Western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)不同LPS濃度下以及LPS刺激后不同時(shí)間段內(nèi)Nogo-B表達(dá)水平。二、分別采用腺病毒轉(zhuǎn)染和siRNA干擾的方法上調(diào)和下調(diào)巨噬細(xì)胞中Nogo-B的表達(dá)水平,選擇LPS刺激的最佳濃度和時(shí)長(zhǎng),采用ELISA方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放情況,Transwell實(shí)驗(yàn)觀察巨噬細(xì)胞的遷移能力的變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面MHC Ⅰ/Ⅱ進(jìn)而評(píng)估其抗原提呈能力,以及Western Blot方法檢測(cè)MSR1進(jìn)而判斷巨噬細(xì)胞的吞噬能力。三、探索LPS刺激下Nogo-B影響巨噬細(xì)胞功能可能的機(jī)制。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同Nogo-B表達(dá)水平的巨噬細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)情況,Western Blot方法檢測(cè)不同Nogo-B表達(dá)水平的巨噬細(xì)胞中MAPK通路相關(guān)分子ERK、JNK和P38的磷酸化水平,以初步闡明Nogo-B通過(guò)TLR4-MAPK通路調(diào)控巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能。結(jié)果:一、LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)Nogo-B的變化規(guī)律巨噬細(xì)胞Nogo-B蛋白隨著LPS刺激濃度的增高而降低,即Nogo-B蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)LPS濃度依賴性降低,在LPS濃度為1μg/ml時(shí)降至最低。當(dāng)LPS刺激濃度為1μg/ml時(shí),巨噬細(xì)胞中Nogo-B的表達(dá)水平隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降,在刺激后的24h其表達(dá)量降至最低并一直持續(xù)到48h。二、LPS刺激后,調(diào)控Nogo-B表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響(一)、LPS刺激后,過(guò)表達(dá)Nogo-B的RAW264.7炎癥因子TNF-α,MCP-1和TGF-β的分泌均較對(duì)照組顯著增加;而低表達(dá)Nogo-B的RAW264.7炎癥因子TNF-α,IL-1β,MCP-1和TGF-β的分泌水平顯著受到抑制。(二)、LPS刺激24h后,過(guò)表達(dá)Nogo-B的RAW264.7遷移能力較對(duì)照組升高1.8倍;而低表達(dá)Nogo-B的RAW264.7則遷移能力較對(duì)照組減低1.5倍。(三)、LPS刺激后MHC Ⅱ在過(guò)表達(dá)Nogo-B的RAW264.7中表達(dá)量隨著LPS刺激時(shí)間的推移顯著增加,而在低表達(dá)Nogo-B的RAW264.7中,MHCⅡ的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。調(diào)控Nogo-B的表達(dá)水平,MHC Ⅰ的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。(四)、LPS刺激后24h,MSR1在過(guò)表達(dá)Nogo-B的RAW264.7中其表達(dá)量明顯升高,而在低表達(dá)Nogo-B的RAW264.7中顯著減少。三、Nogo-B影響巨噬細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)并調(diào)節(jié)MAPK通路的活化LPS刺激后過(guò)表達(dá)Nogo-B的RAW264.7表面TLR4的平均熒光強(qiáng)度以及ERK,JNK和p38的磷酸化水平顯著升高,而低表達(dá)Nogo-B的RAW264.7其表達(dá)量顯著下降。結(jié)論:一、Nogo-B在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平受LPS刺激的影響,LPS濃度為1μg/ml刺激時(shí)間為24h時(shí),RAW264.7中Nogo-B的表達(dá)下降最為顯著。二、Nogo-B的表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放、遷移能力、抗原提呈能力和吞噬能力成正相關(guān)。三、Nogo-B可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)和激活MAPK通路影響巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R563

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