本文關(guān)鍵詞：LOX在百草枯致肺纖維化過程中上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

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【摘要】：百草枯(Paraquat,PQ)中毒是發(fā)展中國家急性中毒患者死亡的主要原因。肺是其主要靶器官,PQ中毒后,迅速在肺內(nèi)積聚,導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞滲透性增加,肺出血、水腫,引起急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合癥,進(jìn)一步發(fā)展為肺纖維化,肺纖維化是PQ中毒導(dǎo)致死亡的主要原因。PQ中毒沒有特殊解毒藥物,因此研究百草枯導(dǎo)致的肺纖維化的機(jī)制具有重要意義。肺纖維化的主要病理特征是肺泡結(jié)構(gòu)破壞,功能喪失,成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)沉積(extracellular matrix,ECM)。在肺纖維化的過程中,分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要是肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞主要有3個(gè)來源,間質(zhì)內(nèi)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞;骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞;肺泡上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)。研究表明EMT是肺纖維化中肌成纖維細(xì)胞的重要來源,目前大量的實(shí)驗(yàn)關(guān)注EMT在纖維化疾病中的研究。在ECM的沉積中起重要作用的是賴氨酰氧化酶(Lysyl oxidase,LOX),LOX是一種銅依賴性氨基酸氧化酶,通過催化細(xì)胞外的膠原蛋白和彈性蛋白特定位置的賴氨酰殘基氧化脫氨,引起分子內(nèi)和分子間的共價(jià)交聯(lián),從而形成穩(wěn)定的不溶性的ECM,在肺纖維化中發(fā)揮重要作用。另外,大量的研究越來越重視LOX在細(xì)胞內(nèi)的功能并提出LOX可能在EMT過程中發(fā)揮作用。我們之前的研究表明EMT在PQ誘導(dǎo)的肺纖維化中發(fā)揮重要作用,因此我們推斷LOX是否在PQ導(dǎo)致的肺纖維化的EMT中發(fā)揮作用。論文主要探討LO X在PQ中毒后導(dǎo)致的肺纖維化過程中與EMT的關(guān)系。本課題進(jìn)行了以下研究:1.觀察百草枯中毒后LOX表達(dá)、肺纖維化及EMT的情況(1)制備PQ中毒大鼠模型,蘇木素-伊紅(HE)和Masson染色評(píng)估肺組織病理學(xué)改變;免疫組化和Western Blot檢測肺組織中LOX蛋白表達(dá);Western Blot檢測肺組織中EMT上皮標(biāo)志蛋白ZO-1、E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)。(2)制備PQ中毒體外模型,采用不同濃度的PQ處理RLE-6TN和A549細(xì)胞24h,觀察細(xì)胞形態(tài)變化;采用Western Blot檢測細(xì)胞上皮和間質(zhì)蛋白表達(dá)變化。2.LOX在百草枯致肺纖維化過程中EMT的作用(1)制備PQ中毒大鼠模型,采用LOX抑制劑BAPN腹腔內(nèi)注射處理動(dòng)物后PQ染毒;蘇木素-伊紅(HE)和Masson染色評(píng)估肺組織病理學(xué)改變;免疫組化和Western Blot檢測肺組織中LO X蛋白表達(dá);Western Blot檢測肺組織中上皮標(biāo)志物、間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。(2)制備PQ中毒體外模型,采用LOX抑制劑BAPN處理細(xì)胞后再PQ染毒;觀察細(xì)胞形態(tài);Western Blot檢測細(xì)胞中LOX、上皮標(biāo)志物和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。(3)制備PQ中毒體外模型,體外采用LOX基因沉默(si RNA)沉默LOX基因再進(jìn)行PQ處理;觀察細(xì)胞形態(tài)的變化;Western Blot檢測細(xì)胞中LOX表達(dá);Western Blot和免疫熒光檢測細(xì)胞中上皮標(biāo)志物和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。主要研究結(jié)果如下:1.HE和Masson染色顯示PQ染毒72 h后大鼠肺內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤和膠原纖維沉積;免疫組化和Western Blot結(jié)果顯示大鼠染毒72 h后肺組織內(nèi)LOX增高;EMT上皮標(biāo)志蛋白ZO-1和E-cadherin在大鼠中毒72 h后表達(dá)減少,間質(zhì)標(biāo)志α-SMA和Vimentin蛋白表達(dá)增強(qiáng)。這一結(jié)果提示PQ中毒后大鼠肺纖維化早期即發(fā)生,并伴隨LOX表達(dá)升高及EMT的發(fā)生。2.獲得PQ誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的體外模型,PQ對細(xì)胞存活率的影響具有濃度依賴性,RLE-6TN細(xì)胞在PQ濃度為80μmol/L時(shí)存活率為47.88%,A549細(xì)胞在PQ濃度800umol/L時(shí)生存率為54.96%,我們以此濃度建立RLE-6TN和A549細(xì)胞PQ中毒的模型。3.PQ處理A549和RLE-6TN細(xì)胞24 h后,細(xì)胞由圓形或卵圓形變成長梭形,LOX蛋白表達(dá)增加,EMT的上皮標(biāo)志E-cadherin和ZO-1表達(dá)降低,間質(zhì)標(biāo)志α-SMA和Vimentin表達(dá)升高,細(xì)胞發(fā)生了EMT。4.應(yīng)用LOX的抑制劑BAPN抑制大鼠LOX蛋白活性,再進(jìn)行PQ處理,肺損傷及纖維化的程度減弱,EMT的程度也減弱。5.應(yīng)用LOX的抑制劑BAPN抑制RLE-6TN和A549細(xì)胞LOX蛋白活性,再進(jìn)行PQ處理,EMT的程度減弱;且減弱程度隨抑制劑的濃度增加而增強(qiáng)。6.si RNA沉默A549細(xì)胞LOX基因后,再進(jìn)行PQ處理24 h,發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞EMT的程度被減弱。7.單純用抑制劑BAPN處理RLE-6TN和A549細(xì)胞和大鼠肺組織后,細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生變化,但EMT標(biāo)志蛋白ZO-1和E-cadherin升高,間質(zhì)標(biāo)志α-SMA和Vimentin水平降低,類似于細(xì)胞發(fā)生了“間質(zhì)向上皮的轉(zhuǎn)化(mesenchymal-to-epithelial transition,MET)”基于以上結(jié)果我們推測,在PQ誘導(dǎo)的肺纖維化過程中,LOX的表達(dá)可以促進(jìn)EMT的進(jìn)展,抑制LOX的活性,EMT的程度被減弱。本項(xiàng)目通過研究LOX及EMT在PQ誘導(dǎo)肺纖維化中的作用及機(jī)制,為尋找干預(yù)PQ所致早期肺纖維化的分子靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),為探討PQ治療手段提供了新的思路。LOX與EMT的關(guān)系可能會(huì)成為治療肺纖維化的潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R595.4;R563

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