本文關(guān)鍵詞：人羊膜勻漿上清液對脂多糖誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷保護作用研究

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【摘要】：目的(1)觀察不同濃度的人羊膜勻漿上清液(human Amniotic Homogenates Supernatant, hAHS)對體外培養(yǎng)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞(Alveolar Type Ⅱ cell, AT-Ⅱ)增殖的影響。(2)探討hAHS對脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)致大鼠AT-Ⅱ損傷后細胞增殖的保護作用及自身表達促炎細胞因子的影響。方法(1) hAHS的制備及其總蛋白與相關(guān)因子含量的測定：取健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦胎膜,PBS沖洗,于無菌條件下剝離人羊膜,同時鑒定其活力。將活力大于95%的人羊膜剪碎后放入EP管,按體積比1：1加入專用培養(yǎng)基勻漿,轉(zhuǎn)移勻漿液并按體積比1：5加入專用培養(yǎng)基后離心,離心后取上清液用細菌過濾器過濾,收集濾液,即得到用于細胞培養(yǎng)的hAHS,-80℃凍存?zhèn)溆�。參照上述方�?將過程中的專用培養(yǎng)基用PBS替代,制得用于細胞因子檢測的hAHS,并用考馬斯亮藍法檢測其總蛋白含量,ELISA法檢測細胞因子EGF、 bFGF、 HGF、 IL-4、 IL-10、 HBD2的含量。(2)觀察不同濃度hAHS對體外培養(yǎng)的大鼠AT-Ⅱ增殖的影響：將第一代AT-Ⅱ培養(yǎng)至90%融合后消化并以2×104cell/mL密度接種于96孔板,每孔200μL,孵育24h,經(jīng)饑餓處理后棄培養(yǎng)液,按分組更換培養(yǎng)基,并隔天換液。根據(jù)培養(yǎng)基配方不同而分為五組(各配方中FBS、hAHS、專用培養(yǎng)基的濃度均指其占培養(yǎng)基總體積的百分數(shù))：0%hAHS組為10%FBS+90%專用培養(yǎng)基,10%hAHS組為10%FBS+80%專用培養(yǎng)基+10%hAHS, 20%hAHS組為10%FBS+70%專用培養(yǎng)基+20%hAHS,40%hAHS組為10%FBS+50%專用培養(yǎng)基+40%hAHS,80%hAHS組為10%FBS+10%專用培養(yǎng)基+80%hAHS。分別于每組第一次更換培養(yǎng)基后的第0(當天)、1、3、5、7天用MTT法檢測各孔的OD值、繪制生長曲線、計算各組細胞增殖率。(3) hAHS對LPS誘導(dǎo)AT-Ⅱ損傷的保護作用：培養(yǎng)第一代AT-Ⅱ至融合度為90%時消化,以1×105cell/mL密度接種于96孔板,每孔200μL。孵育24h,經(jīng)饑餓處理后,按分組更換培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基、LPS及hAHS配比不同分為五組(各組培養(yǎng)基中FBS、 hAHS、專用培養(yǎng)基的濃度均指其占培養(yǎng)基總體積的百分數(shù),LPS濃度均指培養(yǎng)基中LPS的終濃度)：FBS組(對照組)10%FBS+90%專用培養(yǎng)基,hAHS組10%FBS+50%專用培養(yǎng)基+40%hAHS,LPS組10%FBS+90%專用培養(yǎng)基+40μg/mL LPS, LPS+hAHS組10%FBS+50%專用培養(yǎng)基+40%hAHS+40μg/mL LPS。按照實驗分組更換培養(yǎng)基后的第0(當天)、24、48、72h用MTT法檢測細胞OD值,第2、4、6、12、24h收集細胞培養(yǎng)上清液,采用ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中鼠源性IL-1β、TNF-α的含量。結(jié)果(1) hAHS中總蛋白含量為(725.125±12.625)mg/L,其中部分細胞因子含量分別為：EGF(504.785±4.665)、bFGF(4.426±0.138)、HGF(20.763±3.396)ng/L,IL-4(25.650±4.104) ng/L、IL-10 (13.733±2.197) ng/L、Ang-1 (15.561±0.496) ng/L、HBD2 (4.763±0.714) ng/L。(2) hAHS促進AT-ⅡI增殖實驗中,各組生長曲線趨勢為——對照組第1天處于停滯期,第3、5、7天處于對數(shù)期；10%組只有短暫的停滯期,第1、3、5、7天處于對數(shù)期；20%和80%組相似,經(jīng)過短暫的停滯期后,第1、3、5天處于對數(shù)期,第7天處于平穩(wěn)期；40%組只有短暫的停滯期,第1、3、5、7天處于對數(shù)期。各組OD值相比——實驗組各組的OD值在第1、3、5、7天都大于對照組(C組)且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。10%hAHS濃度組的OD值在第1、3、5、7天小于40%hAHS濃度組且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),在第3、5、7天小于20%、80%hAHS濃度組且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。20%hAHS濃度組的OD值在第3、5天小于40%hAHS濃度組且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),在第1、3、天小于80%hAHS濃度組,其中在第3天有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),在第5、7天大于80%hAHS濃度組,其中在第7天有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。40%hAHS濃度組的OD值在第1、3、5天均大于其他實驗各組,其中40%hAHS濃度組的OD值在第1、3、5天大于10%hAHS濃度組且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),40%hAHS濃度組的OD值在第3、5天大于20%、80%hAHS濃度組且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。各組細胞增殖率相比——10%組的增值率在第1、3、5、7天小于40%組且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。20%組的增值率在第3、5天小于40%組且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。80%組的增值率在第3、5、7天小于40%組且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(3) hAHS對LPS致傷的保護實驗中：hAHS組在第24、48、72h的OD值高于FBS組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；IL-1β、TNF-α的含量在各時間點與FBS組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。LPS致傷組在第48、72h的OD值低于FBS組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；IL-1p的含量在第2、4小時高于FBS組,且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),TNF-α的含量在第2、4、6、12小時均高于FBS組,且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。LPS+hAHS組在第24、48、72h的OD值高于LPS組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；IL-1β的含量在2、4小時低于LPS組(P0.05),TNF-α的含量在第2、4、6、12小時低于LPS組,且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論(1) hAHS檢測到了EGF、 bFGF、 HGF、 IL-4、 IL-10、 HBD2。(2) hAHS對體外培養(yǎng)的大鼠AT-Ⅱ增殖有明顯的促進作用,濃度為40%時有最佳的促進效果。(3) hAHS對LPS誘導(dǎo)大鼠AT-Ⅱ損傷后AT-Ⅱ的增殖具有保護作用,并可降低LPS誘導(dǎo)AT-Ⅱ損傷后自身產(chǎn)生的促炎因子IL-1β、TNF-α的表達。
【學(xué)位授予單位】：廣西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R563

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本文編號：1222975