本文關(guān)鍵詞：自噬反應在百草枯致急性呼吸窘迫綜合征和肺泡上皮細胞死亡過程中的作用及其機制研究

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【摘要】：目的 百草枯是一種廣泛運用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的除草劑。百草枯經(jīng)口誤服或自服中毒后急性起病,無特效解毒劑,救治成功率低,病死率高。我國百草枯中毒致死患者呈逐年急劇遞增趨勢。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),百草枯能在肺組織中被肺泡I型上皮細胞、Ⅱ型上皮細胞和Clara細胞主動攝取,因此在肺內(nèi)異常高濃度聚集,肺中濃度可達血漿濃度的6-10倍,該聚集機制與多胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相關(guān)。百草枯吸收后可導致急性呼吸窘迫綜合征,并發(fā)展為急性呼吸衰竭,后期形成肺纖維化。目前,百草枯致急性呼吸窘迫綜合征機制仍不清,且動物模型多采用腹腔注射百草枯建立,與人體經(jīng)口攝入而中毒的途徑不符。 氯喹是一種廣泛運用于臨床的抗瘧藥,因其免疫調(diào)節(jié)作用,也被用于治療免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、病毒感染等疾病中。目前尚無相關(guān)研究,探索氯喹是否能用于百草枯中毒的解救。氯喹的治療作用被認為可能與抑制細胞自噬反應相關(guān)。 本實驗研究采用人肺泡Ⅱ型上皮細胞A549細胞建立百草枯中毒細胞模型,并模擬臨床中毒途徑,通過百草枯灌胃建立穩(wěn)定的急性呼吸窘迫綜合征小鼠模型。同時,通過體外實驗研究氯喹對百草枯攻毒后A549細胞存活率、蛋白表達情況的影響,分析百草枯致急性呼吸窘迫綜合征可能的分子生物學機制,探討自噬反應在百草枯中毒所致肺損傷過程中的作用及其機制。 方法 (一)百草枯灌胃致小鼠急性呼吸窘迫綜合征模型的建立及其致病機制探討 采用不同濃度百草枯(3、10、30、100、150、300mg/kg)灌胃建立小鼠急性呼吸窘迫綜合征模型。根據(jù)小鼠臨床表現(xiàn),確定建立穩(wěn)定模型的百草枯濃度。采用該濃度百草枯灌胃建立小鼠模型后,在1d、2d、3d、4d時觀察小鼠臨床表現(xiàn)、測量肺濕/干比、行HE病理染色以進行研究分析。使用western-blot檢測LC-3蛋白表達情況。 (二)百草枯攻毒并氯喹解救百草枯攻毒A549細胞模型的建立和分子生物學機制探討 1、采用MTS法檢測不同濃度百草枯(0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000μmol/L)對A549細胞生存率的影響情況,確定能建立穩(wěn)定細胞模型的百草枯濃度。 2、使用不同濃度CQ(O.3、1、3、10、30μmol/L)、3-MA(0.3、1、3、5mmol/L)、 LY294002(0.3、1、3、10μmol/L)、 wortmannin (3、10、30、50、100μmol/L)、 necrostatin-1(0.1、0.3、1、3、10μmol/L)、 rolipram(1、3、10、30、100μmol/L)干預PQ100μmol/L濃度攻毒A549細胞,分別于攻毒后12h、24h、48h使用MTS法檢測細胞存活率情況。 3、采用不同濃度氯喹(0.3、1、3、10、30μmol/L)在PQ100μmol/L濃度攻毒0h、1h、3h、6h后對其進行干預,分別于攻毒后12h、24h、48h使用MTS法檢測細胞存活率情況,并使用western-blot檢測LC-3、LAMP-1、LAMP-2等蛋白表達情況,并與PQ攻毒組進行對比。 結(jié)果 (一)成功建立百草枯灌胃致小鼠急性呼吸窘迫綜合征模型 一次性使用百草枯灌胃可以建立小鼠急性呼吸窘迫綜合征模型,建立穩(wěn)定模型的百草枯濃度為300mg/kg。灌胃后,小鼠表現(xiàn)為體重下降,毛發(fā)蓬松無光澤,進食水差,呼吸困難,活動困難。肺濕／干比明顯升高。肺組織充血出血水腫,廣泛炎癥細胞浸潤、肺泡間隔增寬、肺泡結(jié)構(gòu)破壞表現(xiàn)。PQ攻毒組小鼠LC-3表達含量較對照組有先升高后降低的趨勢。 (二)成功建立百草枯致A549細胞死亡模型,成功建立氯喹解救百草枯所致的A549細胞死亡模型 百草枯能導致A549細胞發(fā)生時間、劑量依賴性細胞死亡。能建立穩(wěn)定細胞模型、且使用藥物解救可能有效的百草枯濃度為100μmol/L。 經(jīng)過不同濃度氯喹解救后,百草枯攻毒A549細胞存活率明顯升高。各濃度3-MA、 LY294002、wortmannin、necrostatin-1、rolipram處理后細胞存活率無改善。PQ攻毒后A549細胞LC-3表達先下調(diào)后上調(diào),LAMP-1、LAMP-2表達量有上調(diào)趨勢,CQ解救組LC-3、LAMP-1、LAMP-2表達均上調(diào)。 結(jié)論 1.百草枯能導致肺泡Ⅱ型上皮細胞死亡和小鼠急性呼吸窘迫綜合征。 2.百草枯致急性呼吸窘迫綜合征過程可能存在自噬反應的參與。 3.氯喹能解救百草枯攻毒所致的肺泡Ⅱ型上皮細胞死亡。 4.氯喹解救百草枯攻毒所致的肺泡Ⅱ型上皮細胞死亡可能并非經(jīng)過阻斷或抑制自噬反應途徑、細胞壞死途徑或通過抑制磷酸二酯酶-4(PDE-4)誘導的炎癥反應途徑而發(fā)揮作用,而是通過上調(diào)自噬反應或穩(wěn)定溶酶體膜發(fā)生。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R563.8

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本文編號：1222343