本文關(guān)鍵詞：火藥煙霧致支氣管上皮細(xì)胞損傷及葛根素的干預(yù)研究

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【摘要】：本課題主要研究:1、建立穩(wěn)定的火藥煙霧誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥損傷體系。2、通過對火藥煙霧誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)產(chǎn)生炎癥損傷的研究,揭示火藥煙霧致BEAS-2B細(xì)胞合成、分泌炎癥因子的機(jī)制。3、通過葛根素(puerarin)的干預(yù)研究揭示葛根素在火藥煙霧誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞損傷中的防護(hù)作用,進(jìn)而探討葛根素的防護(hù)機(jī)制。根據(jù)前期研究基礎(chǔ)建立穩(wěn)定的火藥煙霧誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞炎癥損傷的體系,火藥煙霧作用BEAS-2B細(xì)胞10min后將細(xì)胞繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。采用MILLIPLEX○RMAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel試劑盒通過Luminex200多功能流式點(diǎn)陣儀檢測黑火藥煙霧誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子。實(shí)驗(yàn)分組:對照組、煙熏組、煙熏+葛根素組(濃度為100μg/ml,煙霧作用前2h加入)。利用氣體檢測器實(shí)時監(jiān)測火藥煙霧中氣體成分及含量的變化。采用CCK-8試劑盒在酶標(biāo)儀上檢測黑火藥煙霧誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞損傷后細(xì)胞活性及不同劑量葛根素(25、50、100μg/ml)的防護(hù)作用。采用活性氧(ROS)檢測試劑盒(DCFH-DA探針)通過流式細(xì)胞儀檢測火藥煙霧作用BEAS-2B細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)ROS水平。應(yīng)用ELISA方法定量檢測火藥煙霧作用BEAS-2B細(xì)胞后及葛根素干預(yù)后細(xì)胞因子IL-8的分泌變化,實(shí)驗(yàn)分組:對照組、煙熏組(煙霧作用10min后培養(yǎng)不同時間:0h、3h、6h、9h、12h、24h)、煙熏+葛根素組(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)、煙熏+NAC組(2mM、4mM、6mM、8mM、10mM)、煙熏+Bay11-7082抑制劑組(NF-κB的抑制劑,劑量為:1μM、2μM、4μM、8μM)、煙熏+SB203580抑制劑組(P38MAPK的抑制劑,劑量為:10μM)。利用蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測火藥煙霧作用BEAS-2B細(xì)胞后磷酸化蛋白P38MAPK(P-P38MAPK)及磷酸化蛋白IκBα(P-IκBα)的水平情況。檢測結(jié)果顯示1、火藥煙霧作用BEAS-2B細(xì)胞后觀察到細(xì)胞變圓并且細(xì)胞與細(xì)胞之間變稀疏。2、通過細(xì)胞因子的檢測,結(jié)果表明粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)四種有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其中IL-8表達(dá)最穩(wěn)定,加入葛根素干預(yù)后細(xì)胞因子的表達(dá)都相應(yīng)降低。3、火藥煙霧燃燒后氧氣(O2)的含量逐漸降低;煙霧作用10min內(nèi)H2S保持88.2ppm不變;CO的含量隨著時間的延長逐漸升高。4、黑火藥煙霧作用BEAS-2B細(xì)胞后細(xì)胞活力下降,加入葛根素干預(yù)后細(xì)胞活性明顯提高。5、火藥煙霧作用BEAS-2B細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平明顯增加,隨著葛根素干預(yù)劑量的增加,ROS水平呈劑量依賴性降低。6、檢測細(xì)胞因子IL-8的結(jié)果表明:煙霧作用BEAS-2B細(xì)胞后隨著培養(yǎng)時間的延長,IL-8分泌逐漸增加,在24h時表達(dá)最高;火藥煙霧作用后BEAS-2B細(xì)胞后隨著葛根素干預(yù)劑量、NAC濃度、Bay11-7082抑制劑濃度的增加,人支氣管上皮細(xì)胞IL-8的分泌逐漸減少;加入SB203580抑制劑干預(yù)后,IL-8的分泌明顯降低。7、火藥煙霧作用BEAS-2B細(xì)胞10min后P-P38MAPK的水平明顯升高,以后逐漸降低,而P-IκBα的水平在細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2h時升至最高,煙霧作用BEAS-2B細(xì)胞前加入NAC及葛根素干預(yù)后P-P38MAPK及P-IκBα蛋白水平降低,同時加入SB203580及Bay11-7082抑制劑干預(yù)后P-P38MAPK及P-IκBα的水平也降低。綜合以上研究結(jié)果表明:火藥煙霧作用BEAS-2B細(xì)胞后引起多種細(xì)胞因子分泌增加,其中IL-8分泌最穩(wěn)定,同時可引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,加入NAC、SB203580及Bay11-7082抑制劑干預(yù)后IL-8分泌減少,P-P38MAPK及P-IκBα蛋白水平降低�；鹚師熿F誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞分泌IL-8增加的機(jī)制可能通過ROS-P38MAPK及下游NF-κB分子信號通路。同時葛根素對火藥煙霧誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞炎癥具有防護(hù)作用,防護(hù)作用的機(jī)制可能也是通過ROS-P38MAPK及下游NF-κB分子信號通路。
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R56

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：1202757