本文關(guān)鍵詞：環(huán)境雌激素MEHP通過ROS介導(dǎo)的線粒體損傷在TRALI中的作用機制研究

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【摘要】：研究背景及目的： 輸血相關(guān)急性肺損傷(TRALI)是一種罕見但可能致命的輸血反應(yīng),是目前輸血相關(guān)死亡的首要原因[1]。盡管TRALI的危害已經(jīng)被人逐漸認(rèn)識到,但對這種并發(fā)癥的重視程度仍尚顯不夠[2]。目前TRALI的診斷根據(jù)臨床癥狀主要是輸血后6小時內(nèi)發(fā)生急性呼吸窘迫的非心源性肺水腫[3]。TRALI的病理生理機制第一步涉及輸血血液成分中含有獻血者血漿中存在的白細胞的抗體,其中最常見的是人類白細胞抗體(HLA) I類和Ⅱ型抗體[4]。第二步機制涉及到中性粒細胞底物激活的肺生物活性因子造成直接肺血管內(nèi)皮損害,毛細血管滲漏和急性肺損傷[5,6]。無論哪種機制,最后釋放哪種因子最后都是直接作用于肺血管內(nèi)皮從而引起輸血相關(guān)急性肺損傷。 鄰苯二甲酸二乙基已酯(DEHP)及代謝產(chǎn)物鄰苯二酸-單2乙基已酯(MEHP)是環(huán)境雌激素(EEs)中鄰苯二甲酸酯類(PAEs)的一種,被大量應(yīng)用于聚氯乙烯塑料制品中,是在環(huán)境中廣泛存在,可以在人類羊水,臍帶血,人類乳汁,精液,唾液檢測到[7]。 根據(jù)美國Swedish醫(yī)療中心2009年的一份研究報告顯示：在使用血液袋,輸液袋等含鄰苯二甲酸酯的醫(yī)療器械時,血液袋內(nèi)容物中脫落的DEHP及MEHP可以經(jīng)靜脈內(nèi)給藥而直接吸收。使用液相色譜/質(zhì)譜(LCMS)技術(shù)檢測獻血中心有效期內(nèi)第1天至第42天輸血袋上清液中的DEHP和MEHP含量顯示：DEHP的含量從第1天的34.3μM(20.0±SD)顯著增加至第42天的433.2μM(131.2μSD); MEHP顯著從第1天的3.7μM(2.8±D)增加至第42天的74.0μM (19.1±SD)。由此可見使用庫血制品中含量超標(biāo)的的DEHP和MEHP可能是輸血相關(guān)急性肺損傷(TRALI)發(fā)生的一個重要因素。 細胞凋亡作為細胞生物學(xué)在過去的10年研究最多的領(lǐng)域之一,是細胞程序性死亡的主要的研究形式,它在組織穩(wěn)態(tài)發(fā)展過程中的核心作用[8-14]。其中細胞凋亡的眾多信號通路中,Bcl-2家族蛋白是主要參與者。它們的主要功能是調(diào)節(jié)線粒體外膜(OMM)的通透性,釋放不同的凋亡因子,即細胞色素C,Smac/DIABLO, Omi/HtrA2,核酸內(nèi)切酶g,和AIF。Bax作為促凋亡蛋白與鑒定為抗凋亡蛋白的Bcl-2蛋白,同屬Bcl-2家族[15,16]。 N-乙�；腚装彼�(NAC)在谷胱甘肽形成的時候起著重要作用,它直接影響了萃取蛋白質(zhì)的能力,被認(rèn)為是一種強大的抗氧化劑,可以減輕細胞損傷作用[17]。 為了探究MEHP (DEHP在人體內(nèi)會轉(zhuǎn)化生成MEHP)導(dǎo)致輸血相關(guān)急性肺損傷(TRALI)發(fā)生的原因和機制,我們建立體外細胞染毒模型,探討MEHP對血管內(nèi)皮細胞HUVEC的直接毒效應(yīng)及其機制。 試驗方法和結(jié)果： 實驗方法： 1、將HUVEC細胞在含10%胎牛血清濃度的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下培養(yǎng),培養(yǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后,用不同濃度的MEHP (0、6.25、12.5、25、50、100μM)染毒一定時間。 2、用MTT法、流式細胞術(shù)檢測細胞的細胞活力和細胞凋亡率以檢測MEHP對細胞的毒性作用。 3、用DCFH-DA熒光探針、JC-1熒光探針等分別檢測細胞胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生以及線粒體膜電位的變化。 4、用試劑盒檢測細胞胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)包括胞內(nèi)丙二醛(MDA)水平、谷胱甘肽(GSH)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)酶活力的情況。 5、用酶標(biāo)學(xué)的方法檢測細胞凋亡可能存在的凋亡通路,檢測caspase-3、caspase-8、 caspase-9三種酶的活力以驗證內(nèi)源性和外源性凋亡通路。 6、用實時熒光定量PCR方法檢測細胞裂解液中Bax, Bcl-2的含量。 7、Western blot檢測細胞裂解液中Bax, Bcl-2,細胞色素-c蛋白質(zhì)的表達水平。 8、利用用還原劑NAC預(yù)處理后,通過檢測ROS的產(chǎn)生、細胞活力和凋亡率,看ROS是否介導(dǎo)了MEHP的毒效應(yīng)。 結(jié)果： 1、細胞活力顯著下降,細胞活力呈劑量和時間依賴性下降。 2、細胞內(nèi)ROS的生成,隨著濃度的增加,中、高劑量組胞內(nèi)ROS的含量明顯增加。 3、MEHP誘導(dǎo)HUVEC凋亡而導(dǎo)致胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)紊亂。 4、MEHP通過內(nèi)源性和外源性途徑共同誘導(dǎo)HUVEC凋亡。 5、MEHP可以引起細胞內(nèi)Bax和Bcl-2mRNA水平的改變。 6、HUVEC細胞胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平Bax與Bcl-2比值隨著MEHP濃度增加而增加呈劑量依賴性,提示胞內(nèi)促細胞凋亡的存在,而NAC孵育后可以減輕細胞凋亡。 結(jié)論：MEHP誘導(dǎo)HUVEC細胞線粒體的損傷,引起氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化；并能通過ROS介導(dǎo)的內(nèi)源性細胞凋亡通路誘導(dǎo)HUVEC細胞凋亡。MEHP可能誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細胞的凋亡進而導(dǎo)致輸血相關(guān)急性肺損傷(TRALI)的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R563.8

【共引文獻】

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本文編號：1195676