本文關鍵詞：Antiflammin-1抑制博來霉素誘導的肺纖維化及其機制研究

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【摘要】：肺纖維化是嚴重危害健康的呼吸系統(tǒng)常見并發(fā)癥,是各種不同病因的肺間質(zhì)疾病的最后共同結局。由于大部分肺部疾病的最終轉(zhuǎn)歸都伴有不同程度的肺纖維化,因此肺纖維化不僅是肺部疾病轉(zhuǎn)歸的結果,還是導致原有疾病進一步惡化的主要原因。目前肺纖維化的臨床治療以給予皮質(zhì)類固醇類和其他免疫抑制劑藥物為主,但是研究發(fā)現(xiàn)其只對部分肺纖維化患者有效,對特發(fā)性肺纖維化患者療效較差。肺纖維化的發(fā)病率和死亡率近年呈逐漸上升態(tài)勢,對人類健康危害極大。因此,尋找新的治療策略迫在眉睫。 Antiflammin-1(AF-1)是與子宮珠蛋白(uteroglobin, UG)第三個alpha螺旋中的保守序列高度同源的一段寡肽,由于最初發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)具有較強的抗炎作用而得名。AF-1由九肽組成,對應于UG分子中的第39～47位氨基酸(MQMKKVLDS)。研究證實,AF-1具有抗炎、抑制細胞趨化及粘附等多種與UG相似的生物活性。與大分子天然蛋白UG相比較, AF-1的分子量更小,免疫原性更低,因此具有潛在的應用前景。以往的研究集中在對AF-1的抗炎作用和機制的探索上,鑒于UG在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的重要作用和本課題組前期關于AF-1抑制轉(zhuǎn)化生長因子betal (transforming growth factor-betal,TGF-β1)誘導的NIH3T3增殖的作用,本課題首先在整體實驗部分探索AF-1是否具有抑制博來霉素(bleomycin, BLM)誘導的小鼠急性肺炎癥反應和抗肺纖維化的作用。 我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn),UG的活性片段AF-1也能夠特異性地結合UG受體,并且通過UG受體的介導,AF-1能夠特異性的調(diào)節(jié)小鼠成纖維細胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號途徑。由于UG受體同樣表達于肺泡上皮細胞上,那么,既然AF-1能夠通過結合成纖維細胞膜上的UG受體而抑制TGF-β1促增殖的作用。那么是否AF-1同樣能通過上皮細胞膜上的UG受體而發(fā)揮某種生物學功能?本課題進一步在細胞實驗部分嘗試觀察：①AF-11是否能夠抑制TGF-β1誘導的上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的作用?②如果能,是否同樣依賴于UG受體的介導? 第一章AF-1抑制博來霉素誘導的急性肺損傷 方法： 將60只實驗小鼠隨機分為3組,A組為生理鹽水組,B組為BLM組,C組為BLM+AF-1組。單次給予小鼠氣管內(nèi)注射BLM(5mg/kg)以造成小鼠急性肺損傷,每日腹腔注射AF-1(2mg/kg),于BLM給藥7天后收集樣本,檢測肺濕干重比值,HE染色法觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學變化,ELISA法檢測肺組織勻漿TGF-β1、白介素-1beta(interleukin-1β, IL-1β)及腫瘤壞死因子-alpha (tumor necrosis factor-alpha, TNF-a)的濃度,肺組織勻漿髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性的檢測,肺泡灌洗液中細胞分類計數(shù)、蛋白含量及乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDH)活性的檢測。 結果：(1)氣管內(nèi)注射BLM(5mg/kg)后第7天,BLM組肺濕干重比值、肺系數(shù)及MPO活性較正常對照組顯著增加(P0.05),給予AF-1(2mg/kg)處理后,BLM+AF-1組肺濕干重比值及肺系數(shù)明顯下降(P0.05),肺組織勻漿液中MPO活性下降,說明AF-1處理后可抑制BLM肺所致組織水腫和中性粒細胞的滲出。 (2)BLM組肺泡灌洗液中LDH活性和含量均高于正常對照組(P0.05),經(jīng)AF-1處理后,肺泡灌洗液中LDH活性和蛋白含量較BLM組明顯下降(P0.05),說明AF-1處理后可減輕博來霉素所致肺組織的損傷和血漿蛋白的滲出。 (3)BLM組肺泡灌洗液中的細胞總數(shù)、中性粒細胞的數(shù)量和百分比、淋巴細胞的數(shù)量和百分比均顯著升高(P0.05)。經(jīng)AF-1處理后,肺泡灌洗液中細胞總數(shù)、中性粒細胞的數(shù)量和百分比、淋巴細胞的數(shù)量較單獨給予BLM組明顯下降(P0.05),但淋巴細胞的百分比較單獨給予BLM組未見顯著變化,進一步證實AF-1處理后可減輕BLM所致中性粒細胞和淋巴細胞的滲出。 (4)病理切片HE染色顯示,正常小鼠肺泡結構完整,肺泡壁較薄,肺泡內(nèi)未見炎癥細胞浸潤。BLM處理后,肺泡間隔顯著增厚,部分肺泡結構遭到破壞,大量肺泡塌陷,局部肺泡出現(xiàn)代償性擴張,肺泡腔內(nèi)大量炎癥細胞聚集。經(jīng)腹腔注射AF-1(2mg/kg/day)干預后,肺組織炎癥病變明顯減輕。 (5)BLM組小鼠肺組織中細胞因子TGF-β1、IL-1β、 TNF-α的含量與正常對照組相比均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),經(jīng)AF-1處理后,小鼠肺組織中TGF-β1、IL-1β、TNF-α的水平的顯著下降,與單獨給予BLM組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論： 單次給予小鼠氣管內(nèi)注射BLM可引起小鼠急性肺炎癥反應性肺損傷,腹腔給予AF-1可有效抑制BLM可引起小鼠急性肺炎癥反應性肺損傷。 第二章AF-1抑制博來霉素誘導的肺纖維化 方法： 單次給予小鼠氣管內(nèi)注射BLM(5mg/kg)以制備小鼠肺纖維化模型。于BLM給藥的第0、3、7、10、14、21、28天處死小鼠,收集樣本,ELISA法檢測肺組織勻漿中炎癥因子IL-1β.IL-6口TNF-α的動態(tài)變化,堿水解法檢測肺組織中羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)的含量變化。根據(jù)炎癥和纖維化反應在不同時期的發(fā)生發(fā)展過程,制定預防性性給藥方案和治療性給藥方案以確定AF-1是否具有直接的抗纖維化作用。 預防性給藥方案：64只實驗小鼠隨機分為4組,A組為生理鹽水組,B組為AF-1組,C組為BLM組,D組為BLM+AF-1組。從BLM給藥后第0天至第27天,每天腹腔注射AF-1(2mg/kg),第28天處死小鼠收集樣本。治療性給藥方案：從BLM給藥后第11天至第27天,每天腹腔注射AF-1(2或10mg/kg),第28天處死小鼠收集樣本。具體檢測指標為觀察并記錄小鼠第28天時體重的變化及每日的存活率,HE染色及Masson染色法分別觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學改變和膠原纖維分布。堿水解法檢測肺組織中HYP的含量來間接反應膠原沉積程度。RT-PCR法檢測肺組織中EMT相關基因的mRNA的表達情況。 結果： (1)于第0天氣管內(nèi)注入BLM(5mg/kg),分別于給藥后的第0、3、7、10、14、28天處死小鼠,收集各時間點肺組織樣本。結果顯示,IL-1p、IL-6和TNF-a具有相似的動態(tài)表達變化。BLM給藥后第3天IL-1p、IL-6和TNF-a的表達均較第0天顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。高水平的表達一直持續(xù)到第10天,10天后,這三種炎癥細胞因子的表達明顯下降,并于第14天左右均降到接近正常對照水平。在第14天到第28天的一段時間,表達也未出現(xiàn)明顯波動。(2)HYP的含量于前10天未見明顯變化,10天后HYP的表達 顯著升高,第14天BLM組肺組織中HYP的含量較第0天相比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。肺組織中HYP的含量于21天達到高峰,21天至28天的一段時間未出現(xiàn)明顯波動。 (2)給予BLM的小鼠死亡率明顯升高,死亡的小鼠大部分集中于前兩周。BLM組小鼠體重明顯低于對照組(P0.05)。給予AF-1進行干預后,體重的下降的程度也較BLM組有所減輕(P0.05)；小鼠的存活率較BLM組也有明顯上升。 (3)病理切片HE染色顯示,正常小鼠和單純給予AF-1組小鼠肺組織肺泡結構完整,肺泡壁較薄,無出血等病理改變,而BLM給藥28天后,肺組織切片可見大量肺泡萎縮,肺泡腔可見炎癥細胞浸潤,部分肺泡壁出現(xiàn)增厚,斷裂,形成肺大泡。肺間質(zhì)細胞大量增生。預防性給予AF-1可使BLM組小鼠肺組織纖維化病變出現(xiàn)了明顯減輕。 (4)病理切片Masson染色顯示,膠原纖維被較大分子量的苯胺藍所染。正常肺組織肺泡結構清晰,完整,被藍染區(qū)域很少。而給予BLM28天后,部分肺泡壁增厚,斷裂,肺泡結構被破壞,視野內(nèi)大部分區(qū)域被苯胺藍染色,說明膠原、纖維連接蛋白等基質(zhì)大量沉積,預防性給予AF-1可使BLM組小鼠上述病變有所減輕,藍染區(qū)域明顯減少。 (5)給予BLM后,肺組織HYP的含量和Ashcroft score評分顯著增加,預防性給予AF-1(2mg/kg)干預28天后,肺組織HYP的含量和Ashcroft score評分較BLM組顯著下降,說明預防性給予AF-1處理能夠減少BLM誘導的肺組織膠原的沉積。 (6)在治療性給藥實驗中,我們同樣檢測了與預防性實驗相似的指標,我們發(fā)現(xiàn),于BLM給藥后第11天至28天給予小鼠(10mg/kg)的AF-1能夠減輕BLM誘導的肺纖維化,而2mg/kg無此作用。 結論： 單次給予小鼠氣管內(nèi)注射BLM可引起小鼠肺纖維化,腹腔預防性給予AF-1或治療性給予AF-1均可有效減輕BLM肺纖維化,但治療性用藥所需AF-1的劑量大于預防性用藥。 第三章AF-1抑制TGF-β1誘導的A549細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其機制研究 方法： 采用TGF-β1誘導的A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)模型,在干預組中加入100gM的AF-1,觀察AF-1對TGF-β1誘導的A549細胞EMT的影響。于TGF-β1誘導48h后收集細胞,提取總蛋白。在部分實驗中分別加入抗UG受體抗體、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)通路阻斷劑、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK,p38)通路阻斷劑、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)通路阻斷劑以并進一步研究AF-1的作用機制。Western blot檢測A549細胞中alpha-平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)口E-鈣粘素(E-cadherin)的表達水平。 結果：(1)在正常對照組A549細胞的E-cadherin和a-SMA分別呈高表達和低表達,加入TGF-β1后,E-cadherin的表達顯著降低,a-SMA表達水平顯著增高,而給予AF-1干預后,E-cadherin和a-SMA的表達分別高于和低于TGF-β1組。該結果提示AF-1能夠抑制TGF-β1對A549細胞誘導的EMT的轉(zhuǎn)變。(2)為探討抗UG受體在介導AF-1抑制TGF-p1所致EMT中的作用,本實驗室使用抗UG受體的抗體以阻斷UG受體。結果顯示,加入AF-1前預先給予抗UG受體抗體2小時孵育后再給予AF-1,A549細胞a-SMA的表達較TGF-β1+AF-1組有所升高,而E-cadherin的表達較TGF-β1+AF-1組有所下降。該結果提示AF-1有可能通過UG受體抑制TGF-β1誘導的A549細胞EMT改變。 (3)將AF-1作用于A549細胞30分鐘,檢測細胞內(nèi)ERK、p38和JNK的磷酸化水平,ERK、p38和JNK的磷酸化水平顯著高于對照組,但提前孵育抗UG受體抗體2小時后,ERK、p38和JNK其磷酸化的水平顯著下降。說明AF-1通過UG受體誘導ERK,p38和JNK的磷酸化。 (4)為探討MAPK信號通路在介導TGF-β1誘導A549細胞EMT中的作用,我們分別使用了不同MAPK信號通路的阻斷劑。結果顯示,加入p38通路阻斷劑SB203580預處理后,a-SMA的表達較TGF-β1組明顯減少,而E-cadherin的表達較TGF-β1組顯著增加,說明p38通路在TGF-β1誘導的A549細胞的EMT改變中具有顯著作用,在加入JNK通路阻斷劑SP600125后,a-SMA的表達較TGF-β1組未見明顯變化,而E-cadherin的表達較TGF-β1組出現(xiàn)了明顯增加,說明JNK通路在TGF-β1誘導的A549細胞的EMT改變中具有部分作用,而加入ERK通路阻斷劑PD98059后,我們發(fā)現(xiàn)a-SMA及E-cadherin的表達較TGF-β1組均沒有明顯改變,說明ERK通路在TGF-β1誘導的A549細胞的EMT改變中不發(fā)揮作用。 (5)為進一步探討ERK通路是否參與介導AF-1抑制TGF-β1誘導的A549細胞的EMT變化,我們采用對TGF-β1誘導的EMT無明顯作用的ERK通路阻斷劑PD98059來研究UG受體下游信號ERK在AF-1抑制TGF-β1誘導的A549細胞的EMT改變中的作用。我們發(fā)現(xiàn),加入AF-1干預后,α-SMA的表達較TGF-p1組顯著減弱,E-cadherin的表達較TGF-β1組顯著增加,而加入ERK阻斷劑PD98059后,AF-1逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的A549細胞EMT的作用有所減弱,該實驗提示ERK信號通路參與了AF-1逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的A549細胞EMT的作用。 結論： AF-1能夠抑制TGF-β1誘導的A549細胞EMT轉(zhuǎn)變,該作用有賴于UG受體的介導。AF-1通過UG受體誘導A549細胞ERK、p38和JNK的磷酸化。TGF-β1所致A549細胞EMT轉(zhuǎn)化有賴于p38和JNK信號途徑的介導,而與ERK通路無關。但AF-1對TGF-β1誘導EMT的抑制作用需要ERK通路的介導。 總結論 一、AF-1能夠減輕博來霉素誘導的急性炎性肺損傷。 二、在博來霉素肺纖維化模型中,腹腔預防性給予AF-1或治療性給予AF-1均可有效減輕博來霉素肺纖維化,但治療性用藥所需AF-1的劑量大于預防性用藥。提示AF-1在體內(nèi)具有直接的抗纖維化作用。 三、AF-1能夠通過UG受體抑制TGF-β1誘導的A549細胞EMT改變。 四、AF-1通過UG受體激活下游MAPK通路,并且ERK通路參與介導了AF-1對TGF-β1誘導EMT的抑制作用。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R563.9

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本文編號：1190839