本文關(guān)鍵詞：Antiflammin-1抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： antiflammin-1 子宮珠蛋白受體 肺纖維化 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

【摘要】：肺纖維化是嚴(yán)重危害健康的呼吸系統(tǒng)常見并發(fā)癥,是各種不同病因的肺間質(zhì)疾病的最后共同結(jié)局。由于大部分肺部疾病的最終轉(zhuǎn)歸都伴有不同程度的肺纖維化,因此肺纖維化不僅是肺部疾病轉(zhuǎn)歸的結(jié)果,還是導(dǎo)致原有疾病進(jìn)一步惡化的主要原因。目前肺纖維化的臨床治療以給予皮質(zhì)類固醇類和其他免疫抑制劑藥物為主,但是研究發(fā)現(xiàn)其只對部分肺纖維化患者有效,對特發(fā)性肺纖維化患者療效較差。肺纖維化的發(fā)病率和死亡率近年呈逐漸上升態(tài)勢,對人類健康危害極大。因此,尋找新的治療策略迫在眉睫。 Antiflammin-1(AF-1)是與子宮珠蛋白(uteroglobin, UG)第三個(gè)alpha螺旋中的保守序列高度同源的一段寡肽,由于最初發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)具有較強(qiáng)的抗炎作用而得名。AF-1由九肽組成,對應(yīng)于UG分子中的第39～47位氨基酸(MQMKKVLDS)。研究證實(shí),AF-1具有抗炎、抑制細(xì)胞趨化及粘附等多種與UG相似的生物活性。與大分子天然蛋白UG相比較, AF-1的分子量更小,免疫原性更低,因此具有潛在的應(yīng)用前景。以往的研究集中在對AF-1的抗炎作用和機(jī)制的探索上,鑒于UG在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的重要作用和本課題組前期關(guān)于AF-1抑制轉(zhuǎn)化生長因子betal (transforming growth factor-betal,TGF-β1)誘導(dǎo)的NIH3T3增殖的作用,本課題首先在整體實(shí)驗(yàn)部分探索AF-1是否具有抑制博來霉素(bleomycin, BLM)誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎癥反應(yīng)和抗肺纖維化的作用。 我們在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),UG的活性片段AF-1也能夠特異性地結(jié)合UG受體,并且通過UG受體的介導(dǎo),AF-1能夠特異性的調(diào)節(jié)小鼠成纖維細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)途徑。由于UG受體同樣表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞上,那么,既然AF-1能夠通過結(jié)合成纖維細(xì)胞膜上的UG受體而抑制TGF-β1促增殖的作用。那么是否AF-1同樣能通過上皮細(xì)胞膜上的UG受體而發(fā)揮某種生物學(xué)功能?本課題進(jìn)一步在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分嘗試觀察：①AF-11是否能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的作用?②如果能,是否同樣依賴于UG受體的介導(dǎo)? 第一章AF-1抑制博來霉素誘導(dǎo)的急性肺損傷 方法： 將60只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組,A組為生理鹽水組,B組為BLM組,C組為BLM+AF-1組。單次給予小鼠氣管內(nèi)注射BLM(5mg/kg)以造成小鼠急性肺損傷,每日腹腔注射AF-1(2mg/kg),于BLM給藥7天后收集樣本,檢測肺濕干重比值,HE染色法觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化,ELISA法檢測肺組織勻漿TGF-β1、白介素-1beta(interleukin-1β, IL-1β)及腫瘤壞死因子-alpha (tumor necrosis factor-alpha, TNF-a)的濃度,肺組織勻漿髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性的檢測,肺泡灌洗液中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、蛋白含量及乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDH)活性的檢測。 結(jié)果：(1)氣管內(nèi)注射BLM(5mg/kg)后第7天,BLM組肺濕干重比值、肺系數(shù)及MPO活性較正常對照組顯著增加(P0.05),給予AF-1(2mg/kg)處理后,BLM+AF-1組肺濕干重比值及肺系數(shù)明顯下降(P0.05),肺組織勻漿液中MPO活性下降,說明AF-1處理后可抑制BLM肺所致組織水腫和中性粒細(xì)胞的滲出。 (2)BLM組肺泡灌洗液中LDH活性和含量均高于正常對照組(P0.05),經(jīng)AF-1處理后,肺泡灌洗液中LDH活性和蛋白含量較BLM組明顯下降(P0.05),說明AF-1處理后可減輕博來霉素所致肺組織的損傷和血漿蛋白的滲出。 (3)BLM組肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞的數(shù)量和百分比、淋巴細(xì)胞的數(shù)量和百分比均顯著升高(P0.05)。經(jīng)AF-1處理后,肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞的數(shù)量和百分比、淋巴細(xì)胞的數(shù)量較單獨(dú)給予BLM組明顯下降(P0.05),但淋巴細(xì)胞的百分比較單獨(dú)給予BLM組未見顯著變化,進(jìn)一步證實(shí)AF-1處理后可減輕BLM所致中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的滲出。 (4)病理切片HE染色顯示,正常小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡壁較薄,肺泡內(nèi)未見炎癥細(xì)胞浸潤。BLM處理后,肺泡間隔顯著增厚,部分肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞,大量肺泡塌陷,局部肺泡出現(xiàn)代償性擴(kuò)張,肺泡腔內(nèi)大量炎癥細(xì)胞聚集。經(jīng)腹腔注射AF-1(2mg/kg/day)干預(yù)后,肺組織炎癥病變明顯減輕。 (5)BLM組小鼠肺組織中細(xì)胞因子TGF-β1、IL-1β、 TNF-α的含量與正常對照組相比均明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),經(jīng)AF-1處理后,小鼠肺組織中TGF-β1、IL-1β、TNF-α的水平的顯著下降,與單獨(dú)給予BLM組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 單次給予小鼠氣管內(nèi)注射BLM可引起小鼠急性肺炎癥反應(yīng)性肺損傷,腹腔給予AF-1可有效抑制BLM可引起小鼠急性肺炎癥反應(yīng)性肺損傷。 第二章AF-1抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化 方法： 單次給予小鼠氣管內(nèi)注射BLM(5mg/kg)以制備小鼠肺纖維化模型。于BLM給藥的第0、3、7、10、14、21、28天處死小鼠,收集樣本,ELISA法檢測肺組織勻漿中炎癥因子IL-1β.IL-6口TNF-α的動(dòng)態(tài)變化,堿水解法檢測肺組織中羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)的含量變化。根據(jù)炎癥和纖維化反應(yīng)在不同時(shí)期的發(fā)生發(fā)展過程,制定預(yù)防性性給藥方案和治療性給藥方案以確定AF-1是否具有直接的抗纖維化作用。 預(yù)防性給藥方案：64只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組,A組為生理鹽水組,B組為AF-1組,C組為BLM組,D組為BLM+AF-1組。從BLM給藥后第0天至第27天,每天腹腔注射AF-1(2mg/kg),第28天處死小鼠收集樣本。治療性給藥方案：從BLM給藥后第11天至第27天,每天腹腔注射AF-1(2或10mg/kg),第28天處死小鼠收集樣本。具體檢測指標(biāo)為觀察并記錄小鼠第28天時(shí)體重的變化及每日的存活率,HE染色及Masson染色法分別觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變和膠原纖維分布。堿水解法檢測肺組織中HYP的含量來間接反應(yīng)膠原沉積程度。RT-PCR法檢測肺組織中EMT相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果： (1)于第0天氣管內(nèi)注入BLM(5mg/kg),分別于給藥后的第0、3、7、10、14、28天處死小鼠,收集各時(shí)間點(diǎn)肺組織樣本。結(jié)果顯示,IL-1p、IL-6和TNF-a具有相似的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。BLM給藥后第3天IL-1p、IL-6和TNF-a的表達(dá)均較第0天顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。高水平的表達(dá)一直持續(xù)到第10天,10天后,這三種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)明顯下降,并于第14天左右均降到接近正常對照水平。在第14天到第28天的一段時(shí)間,表達(dá)也未出現(xiàn)明顯波動(dòng)。(2)HYP的含量于前10天未見明顯變化,10天后HYP的表達(dá) 顯著升高,第14天BLM組肺組織中HYP的含量較第0天相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。肺組織中HYP的含量于21天達(dá)到高峰,21天至28天的一段時(shí)間未出現(xiàn)明顯波動(dòng)。 (2)給予BLM的小鼠死亡率明顯升高,死亡的小鼠大部分集中于前兩周。BLM組小鼠體重明顯低于對照組(P0.05)。給予AF-1進(jìn)行干預(yù)后,體重的下降的程度也較BLM組有所減輕(P0.05)；小鼠的存活率較BLM組也有明顯上升。 (3)病理切片HE染色顯示,正常小鼠和單純給予AF-1組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡壁較薄,無出血等病理改變,而BLM給藥28天后,肺組織切片可見大量肺泡萎縮,肺泡腔可見炎癥細(xì)胞浸潤,部分肺泡壁出現(xiàn)增厚,斷裂,形成肺大泡。肺間質(zhì)細(xì)胞大量增生。預(yù)防性給予AF-1可使BLM組小鼠肺組織纖維化病變出現(xiàn)了明顯減輕。 (4)病理切片Masson染色顯示,膠原纖維被較大分子量的苯胺藍(lán)所染。正常肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰,完整,被藍(lán)染區(qū)域很少。而給予BLM28天后,部分肺泡壁增厚,斷裂,肺泡結(jié)構(gòu)被破壞,視野內(nèi)大部分區(qū)域被苯胺藍(lán)染色,說明膠原、纖維連接蛋白等基質(zhì)大量沉積,預(yù)防性給予AF-1可使BLM組小鼠上述病變有所減輕,藍(lán)染區(qū)域明顯減少。 (5)給予BLM后,肺組織HYP的含量和Ashcroft score評(píng)分顯著增加,預(yù)防性給予AF-1(2mg/kg)干預(yù)28天后,肺組織HYP的含量和Ashcroft score評(píng)分較BLM組顯著下降,說明預(yù)防性給予AF-1處理能夠減少BLM誘導(dǎo)的肺組織膠原的沉積。 (6)在治療性給藥實(shí)驗(yàn)中,我們同樣檢測了與預(yù)防性實(shí)驗(yàn)相似的指標(biāo),我們發(fā)現(xiàn),于BLM給藥后第11天至28天給予小鼠(10mg/kg)的AF-1能夠減輕BLM誘導(dǎo)的肺纖維化,而2mg/kg無此作用。 結(jié)論： 單次給予小鼠氣管內(nèi)注射BLM可引起小鼠肺纖維化,腹腔預(yù)防性給予AF-1或治療性給予AF-1均可有效減輕BLM肺纖維化,但治療性用藥所需AF-1的劑量大于預(yù)防性用藥。 第三章AF-1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其機(jī)制研究 方法： 采用TGF-β1誘導(dǎo)的A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)模型,在干預(yù)組中加入100gM的AF-1,觀察AF-1對TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT的影響。于TGF-β1誘導(dǎo)48h后收集細(xì)胞,提取總蛋白。在部分實(shí)驗(yàn)中分別加入抗UG受體抗體、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)通路阻斷劑、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK,p38)通路阻斷劑、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)通路阻斷劑以并進(jìn)一步研究AF-1的作用機(jī)制。Western blot檢測A549細(xì)胞中alpha-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)口E-鈣粘素(E-cadherin)的表達(dá)水平。 結(jié)果：(1)在正常對照組A549細(xì)胞的E-cadherin和a-SMA分別呈高表達(dá)和低表達(dá),加入TGF-β1后,E-cadherin的表達(dá)顯著降低,a-SMA表達(dá)水平顯著增高,而給予AF-1干預(yù)后,E-cadherin和a-SMA的表達(dá)分別高于和低于TGF-β1組。該結(jié)果提示AF-1能夠抑制TGF-β1對A549細(xì)胞誘導(dǎo)的EMT的轉(zhuǎn)變。(2)為探討抗UG受體在介導(dǎo)AF-1抑制TGF-p1所致EMT中的作用,本實(shí)驗(yàn)室使用抗UG受體的抗體以阻斷UG受體。結(jié)果顯示,加入AF-1前預(yù)先給予抗UG受體抗體2小時(shí)孵育后再給予AF-1,A549細(xì)胞a-SMA的表達(dá)較TGF-β1+AF-1組有所升高,而E-cadherin的表達(dá)較TGF-β1+AF-1組有所下降。該結(jié)果提示AF-1有可能通過UG受體抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT改變。 (3)將AF-1作用于A549細(xì)胞30分鐘,檢測細(xì)胞內(nèi)ERK、p38和JNK的磷酸化水平,ERK、p38和JNK的磷酸化水平顯著高于對照組,但提前孵育抗UG受體抗體2小時(shí)后,ERK、p38和JNK其磷酸化的水平顯著下降。說明AF-1通過UG受體誘導(dǎo)ERK,p38和JNK的磷酸化。 (4)為探討MAPK信號(hào)通路在介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT中的作用,我們分別使用了不同MAPK信號(hào)通路的阻斷劑。結(jié)果顯示,加入p38通路阻斷劑SB203580預(yù)處理后,a-SMA的表達(dá)較TGF-β1組明顯減少,而E-cadherin的表達(dá)較TGF-β1組顯著增加,說明p38通路在TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的EMT改變中具有顯著作用,在加入JNK通路阻斷劑SP600125后,a-SMA的表達(dá)較TGF-β1組未見明顯變化,而E-cadherin的表達(dá)較TGF-β1組出現(xiàn)了明顯增加,說明JNK通路在TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的EMT改變中具有部分作用,而加入ERK通路阻斷劑PD98059后,我們發(fā)現(xiàn)a-SMA及E-cadherin的表達(dá)較TGF-β1組均沒有明顯改變,說明ERK通路在TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的EMT改變中不發(fā)揮作用。 (5)為進(jìn)一步探討ERK通路是否參與介導(dǎo)AF-1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的EMT變化,我們采用對TGF-β1誘導(dǎo)的EMT無明顯作用的ERK通路阻斷劑PD98059來研究UG受體下游信號(hào)ERK在AF-1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的EMT改變中的作用。我們發(fā)現(xiàn),加入AF-1干預(yù)后,α-SMA的表達(dá)較TGF-p1組顯著減弱,E-cadherin的表達(dá)較TGF-β1組顯著增加,而加入ERK阻斷劑PD98059后,AF-1逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT的作用有所減弱,該實(shí)驗(yàn)提示ERK信號(hào)通路參與了AF-1逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT的作用。 結(jié)論： AF-1能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)變,該作用有賴于UG受體的介導(dǎo)。AF-1通過UG受體誘導(dǎo)A549細(xì)胞ERK、p38和JNK的磷酸化。TGF-β1所致A549細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化有賴于p38和JNK信號(hào)途徑的介導(dǎo),而與ERK通路無關(guān)。但AF-1對TGF-β1誘導(dǎo)EMT的抑制作用需要ERK通路的介導(dǎo)。 總結(jié)論 一、AF-1能夠減輕博來霉素誘導(dǎo)的急性炎性肺損傷。 二、在博來霉素肺纖維化模型中,腹腔預(yù)防性給予AF-1或治療性給予AF-1均可有效減輕博來霉素肺纖維化,但治療性用藥所需AF-1的劑量大于預(yù)防性用藥。提示AF-1在體內(nèi)具有直接的抗纖維化作用。 三、AF-1能夠通過UG受體抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT改變。 四、AF-1通過UG受體激活下游MAPK通路,并且ERK通路參與介導(dǎo)了AF-1對TGF-β1誘導(dǎo)EMT的抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563.9

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 靜雨;;自發(fā)性肺纖維化的新療法[J];國外醫(yī)學(xué)情報(bào);2001年08期

2 陳永鳳,劉巨源,許彩青,暴秀梅;肺纖維化大鼠肺組織鈣含量及鈣調(diào)素活性的研究[J];天津醫(yī)藥;2002年09期

3 陳曉玲,李英敏,黃善生,王殿華,李文斌;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶對肺纖維化形成的促進(jìn)作用[J];中國病理生理雜志;2002年10期

4 崔曉聰,鄭桂鳳;藥物致剝脫性皮炎型藥疹并肺纖維化1例報(bào)告[J];華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2002年03期

5 劉濤,宋良文;肺纖維化發(fā)生的分子機(jī)制和早期防治研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2003年04期

6 王金勝,曾慶富;肺纖維化的分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2004年06期

7 張吉平;甘紅英;;轉(zhuǎn)化生長因子β_1及其受體在類風(fēng)濕性肺纖維化中的作用[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2004年08期

8 婁克儉;肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展(綜述)[J];中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生;2005年04期

9 宮麗],任進(jìn);腎素-血管緊張素系統(tǒng)對肺纖維化形成的調(diào)節(jié)[J];中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2005年05期

10 翟秀軍,宋道遠(yuǎn);老年肺纖維化臨床分析[J];中國老年學(xué)雜志;2005年09期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊s，

本文編號(hào)：1190839