本文關鍵詞：酪氨酸磷酸酶SHP2在過敏性氣道炎癥的嗜酸性粒細胞分化中的作用機制研究

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【摘要】：背景：哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病,主要表現(xiàn)為可逆性的氣道高反應性,氣道炎癥細胞的浸潤,尤其是以氣道嗜酸性粒細胞大量浸潤為典型特征。嗜酸性粒細胞在哮喘中還表現(xiàn)為一種關鍵的效應性細胞,很多研究表明哮喘的嚴重程度是和嗜酸性粒細胞的活化以及數(shù)量增多呈正相關的。而且研究還發(fā)現(xiàn)過敏性支氣管哮喘患者骨髓中的嗜酸性粒細胞水平明顯增高。嗜酸性粒細胞從骨髓中發(fā)育而來,在趨化因子如Eotaxin的作用下進入血液并遷移至肺部組織從而發(fā)揮炎癥反的作用。小鼠的嗜酸性粒細胞是從粒單核細胞系祖細胞(GMPs)分化為中間狀態(tài)的嗜酸性粒細胞祖細胞(EoPs)后再由EoPs分化而來,而對于人類來說,嗜酸性粒細胞祖細胞則是從共同髓系祖細胞或者其上游的多潛能祖細胞產(chǎn)生的。在嗜酸性粒細胞祖細胞表面表達有IL-5Rα,這是EoPs區(qū)別于GMPs的重要特征,而這也意味著IL-5能夠促進嗜酸性粒細胞祖細胞分化為嗜酸性粒細胞,而不是在GMPs分化為EoPs的過程中起作用。酪氨酸磷酸酶SHP2是一種廣泛表達的胞內(nèi)蛋白,包括兩個SH2結構域和一個具有催化功能的酪氨酸磷酸酶結構域。SHP2在很多重要的生理活動中起作用。研究發(fā)現(xiàn)SHP2能參與很多信號通路,介導T細胞的發(fā)育,可通過刺激CEBPα基因的表達而調(diào)控了細胞因子依賴的粒細胞產(chǎn)生過程。正常的SHP2功能在維持胚胎干細胞的穩(wěn)態(tài)以及造血干祖細胞池的動態(tài)穩(wěn)定中起著重要的作用。而近期的研究也發(fā)現(xiàn)SHP2在香煙煙霧誘導的肺部炎癥反應中也有重要的作用。我們實驗室在之前的研究中發(fā)現(xiàn)在小鼠氣道上皮中條件性敲除shp2基因能有效降低TGF-β1的產(chǎn)生從而在哮喘慢性氣道重構中起作用,且在哮喘小鼠氣道慢性重構模型的BALF中嗜酸性粒細胞水平明顯減少。那么SHP2除了可作用于氣道上皮之外,在哮喘的發(fā)病過程中是否也能作用于骨髓嗜酸性粒細胞的產(chǎn)生及分化過程呢?嗜酸性粒細胞在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵性的作用,因此深入研究嗜酸性粒細胞分化過程中的具體機制也顯得尤為重要。因此,本課題的研究重點是酪氨酸磷酸酶SHP2是否能影響嗜酸性粒細胞的產(chǎn)生和分化過程,又是如何在嗜酸性粒細胞分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用的。通過給予SHP2特異性抑制劑PHPS-1及利用帶重組酶Cre的腺病毒實現(xiàn)體外敲除shp2以及構建特異性髓系shp2敲除的小鼠進行體內(nèi)和體外研究,我們發(fā)現(xiàn)SHP2在骨髓失活或者敲除后能明顯減少哮喘小鼠氣道中的嗜酸性粒細胞水平,有效緩解肺部嗜酸性粒細胞性氣道炎癥,降低氣道高反應性,而這都是與SHP2直接抑制骨髓中嗜酸性粒細胞的分化密切相關的。而這些實驗結果也提示SHP2在嗜酸性粒細胞分化過程中可能是一個重要的調(diào)控因子,因此有可能成為未來哮喘治療的一個有效靶點。具體研究分為三大部分：(1)SHP2在哮喘小鼠氣道炎癥和骨髓嗜酸性粒細胞產(chǎn)生中的作用研究； (2)SHP2在嗜酸性粒細胞分化過程中的調(diào)控作用研究；(3)髓系敲除shp2在哮喘小鼠嗜酸性粒細胞性氣道炎癥和骨髓嗜酸性粒細胞分化中的調(diào)控作用。第一部分SHP2在哮喘小鼠氣道炎癥和骨髓嗜酸性粒細胞產(chǎn)生中的作用研究目的：構建卵清蛋白誘導引起的急性哮喘小鼠模型,探索SHP2在哮喘小鼠嗜酸性粒細胞性氣道炎癥中的作用及其作用機制。方法：6-8周齡的C57BL/6雄性小鼠按體重大小編號,根據(jù)隨機數(shù)字表產(chǎn)生隨機數(shù)字,按照隨機數(shù)字大小分組,將實驗小鼠平均分為SHAM+PBS組、SHAM+PHPS-1組、OVA+PBS組和OVA+PHPS-1組。SHAM組給予PBS致敏霧化,PHPS-1組給予小鼠PBS或者OVA致敏和霧化,并在霧化前1小時腹腔注射PHPS-1 (5mg/kg)。觀察各組小鼠肺泡支氣管灌洗液中細胞總數(shù)、細胞分類計數(shù)和病理學檢測；采用熒光定量PCR檢測肺組織Th2型炎癥因子的表達；采用ELISA的方法檢測肺組織勻漿中炎癥因子的表達；檢測外周血和骨髓細胞中嗜酸性粒細胞比例和數(shù)量的改變；采用流式細胞術方法檢測骨髓中EoPs和GMPs的比例和數(shù)量的改變。在末次抗原激發(fā)后24小時收集小鼠骨髓細胞進行嗜酸性粒細胞克隆形成試驗和檢測GATA-1 mRNA水平。結果：本實驗利用卵清蛋白致敏霧化構建急性哮喘小鼠模型。通過對SHAM+PBS組和OVA+PBS組的BALF細胞數(shù)、肺組織病理學以及炎癥因子表達等多項指標的檢測,符合急性哮喘模型的特征,提示造模成功。通過霧化前1小鼠腹腔注射PHPS-1,與OVA+PBS組相比,PHPS-1干預哮喘小鼠之后,BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞比例和絕對數(shù)量均有明顯下降(P0.001);肺組織病理學HE染色結果提示：PHPS-1干預哮喘小鼠之后明顯減少支氣管和血管之間的炎癥細胞浸潤,支氣管上皮增生肥厚現(xiàn)象也明顯改善(P0.01);肺組織病理學PAS染色結果提示：PHPS-1干預后能明顯抑制抗原誘導的肺組織內(nèi)粘液分泌增多,表現(xiàn)為PAS陽性顆粒數(shù)明顯減少(P0.001);肺組織炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達下調(diào)(P0.05);肺組織勻漿中炎癥因子IL-4和IL-13的蛋白表達也下調(diào)(P0.05);流式細胞術檢測骨髓中嗜酸性粒細胞和嗜酸性粒細胞祖細胞的水平也明顯減少(P0.05),但不影響GMPs的水平以及骨髓嗜酸性粒細胞的體內(nèi)凋亡水平；外周血中嗜酸性粒細胞數(shù)量同樣減少,但不改變外周血中IL-5的水平。結論：PHPS-1對急性哮喘小鼠的嗜酸性粒細胞性氣道炎癥具有保護作用,其可能機制是下調(diào)炎癥因子,減少炎癥細胞在肺內(nèi)的浸潤,并減少骨髓嗜酸性粒細胞的產(chǎn)生；而抑制嗜酸性粒細胞產(chǎn)生的可能機制并不是通過影響嗜酸性粒細胞的凋亡,而可能是通過抑制嗜酸性粒細胞祖細胞的水平或者嗜酸性粒細胞的分化過程而實現(xiàn)的。第二部分SHP2在嗜酸性粒細胞分化過程中的調(diào)控作用研究目的：研究體外抑制或者敲除shp2在小鼠骨髓嗜酸性粒細胞分化和凋亡中的作用機制。方法：提取野生型小鼠骨髓非粘附單個核細胞(NAMNCs)進行嗜酸性粒細胞體外分化實驗,在培養(yǎng)第4天體外給予20uM PHPS-1,在不同分化時間通過流式檢測嗜酸性粒細胞水平以及凋亡,并檢測不同分化時間SHP2蛋白水平,GATA-1和MBP mRNA水平,同時檢測嗜酸性粒細胞克隆形成單位(Eos-CFU)。利用腺病毒Ade-Cre-GFP體外敲除shp2后觀察Eos-CFU、嗜酸性粒細胞數(shù)量和GATA-1 mRNA水平。并提取野生型小鼠骨髓流式分選lineage陰性細胞,在G-CSF的刺激下誘導中性粒細胞分化,并在培養(yǎng)過程中給予不同濃度的PHPS-1,研究SHP2在中性粒細胞分化過程中的作用。結果：在體外實驗中,無論PHPS-1干預或腺病毒介導的shp2敲除后骨髓的Eos-CFU皆明顯下降,嗜酸性粒細胞在不同分化時間的比例也顯著下降,而GATA-1 mRNA表達水平明顯抑制,皆有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而PHPS-1體外干預后嗜酸性粒細胞分化過程明顯受抑制,但不影響嗜酸性粒細胞的凋亡。結論： SHP2參與骨髓嗜酸性粒細胞的分化過程,而該作用可能是通過作用轉錄因子GATA-1實現(xiàn)的。阻斷SHP2能有效抑制骨髓嗜酸性粒細胞的分化,但對分化過程中的嗜酸性粒細胞凋亡則并無明顯作用。第三部分 髓系敲除shp2在哮喘小鼠嗜酸性粒細胞性氣道炎癥和骨髓嗜酸性粒細胞分化中的調(diào)控作用目的：研究髓系shp2敲除后對哮喘小鼠骨髓嗜酸性粒細胞分化和哮喘氣道炎癥的調(diào)控機制。方法：利用Lysmcre shp2flox/flox小鼠建立急性哮喘模型,在末次抗原激發(fā)后24小時收集小鼠BALF進行細胞分類計數(shù),肺組織HE和PAS染色,研究髓系敲除shp2的哮喘小鼠氣道和肺部炎癥改變。同時利用Lysmcre shp2flox/flox小鼠骨髓進行體外誘導嗜酸性粒細胞分化,檢測嗜酸性粒細胞的水平及相關信號通路。并在野生型小鼠骨髓嗜酸性粒細胞分化過程中給予Erk抑制劑U0126后檢測嗜酸性粒細胞水平。結果：與shp2flox/flox哮喘小鼠相比,Lysmcre shp2flox/flox哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒細胞數(shù)量顯著下降,肺組織病理學結果提示髓系shp2敲除的哮喘小鼠中支氣管和血管之間的炎癥細胞浸潤明顯減少,肺組織內(nèi)粘液分泌增多受到抑制,肺組織炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達下調(diào)(P0.05)。而通過體外誘導嗜酸性粒細胞分化的研究發(fā)現(xiàn),髓系shp2敲除后的骨髓細胞在嗜酸性粒細胞體外分化過程中p-Erk的表達明顯下降,且Erk抑制劑U0126同樣能抑制嗜酸性粒細胞的分化過程,提示SHP2調(diào)控嗜酸性粒細胞的分化過程可能是通過調(diào)控p-Erk實現(xiàn)的。結論：髓系shp2敲除后可明顯緩解哮喘小鼠的嗜酸性粒細胞性氣道炎癥,抑制肺部炎癥細胞浸潤以及粘液高分泌,并能抑制骨髓嗜酸性粒細胞的分化,提示SHP2在嗜酸性粒細胞分化過程中起著重要的調(diào)控作用,而其作用機制可能是通過調(diào)控Erk信號通路而實現(xiàn)。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R562.25
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本文編號：1184909