本文關(guān)鍵詞：淋巴細(xì)胞微粒誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥模型的建立及評價

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【摘要】：研究背景和目的： 淋巴細(xì)胞微粒（lymphocyte-derived microparticels，LMPs）[1]是當(dāng)淋巴細(xì)胞受刺激凋亡或活化時從漿膜上脫落形成的小囊泡顆粒,其直徑約0.05-1.0μm。LMPs作為細(xì)胞間傳遞生物信息的重要介質(zhì)，有多種生物學(xué)活性，例如促進(jìn)炎癥反應(yīng)[2]、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[3][4]、調(diào)節(jié)血管張力[5][6]、調(diào)節(jié)血管生成[7][8][9]等。 LMPs參與炎癥反應(yīng)時，通過促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)釋放、粘附分子表達(dá)而實現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)。臨床研究發(fā)現(xiàn)COPD患者的支氣管肺泡灌洗液（BALF）中存在著病理性升高的LMPs，且LMPs的量和疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。在COPD患者緩解期和急性發(fā)作期誘導(dǎo)痰中和血清中均發(fā)現(xiàn)升高的IL-1β，和氣道阻塞的嚴(yán)重程度正相關(guān)，與FEV1/FVC%呈顯著負(fù)相關(guān)[10]。Imaoka等[11]和Hoshino等[12]亦證實IL-18的過表達(dá)參與了COPD的發(fā)病進(jìn)程。我們課題組首次發(fā)現(xiàn)，LMPs在體外可以誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6和IL-18等細(xì)胞因子，并能導(dǎo)致上皮細(xì)胞凋亡[13]�？梢�，IL-1β和IL-18在COPD氣道炎癥中起著極其重要的作用。 因此，我們推測LMPs與氣道炎癥密切相關(guān)，但LMPs在體內(nèi)能否誘導(dǎo)氣道炎癥以及相關(guān)的炎癥機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過LMPs誘導(dǎo)建立BALB/c小鼠氣道炎癥模型，并通過評價小鼠氣道及肺部炎癥水平來探討LMPs在氣道炎癥發(fā)生中的作用，為進(jìn)一步探討LMPs與氣道炎癥的關(guān)系提供新的線索和基礎(chǔ)研究，進(jìn)而為臨床防治氣道炎癥，尤其是COPD、哮喘等氣道炎癥提供新的干預(yù)靶點和方向。 方法 1. LMPs致BALB/c小鼠氣道炎癥模型的建立 1.1LMPs制備 首先進(jìn)行T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株(6T-CEM)培養(yǎng)，于底面積25cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞狀態(tài)良好的情況下，加入終濃度為0.5μg/ml的放線菌素D溶液(actinomycin D)處理6T-CEM細(xì)胞24h[14]。然后離心細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，于12000g/min低溫離心機(jī)離心50min×3，取沉淀，PBS重懸，得到LMPs重懸液。流式細(xì)胞儀對LMPs進(jìn)行鑒定，測定LMPs蛋白濃度。 1.2LMPs致BALB/c小鼠氣道炎癥模型的建立 1.2.1LMPs致炎模型最佳誘導(dǎo)濃度的篩選 24只雌性BALB/C小鼠隨機(jī)分為4組（每組n=6）：正常對照組A組和根據(jù)藥物濃度分誘導(dǎo)炎癥B組（20μg/ml）、C組（50μg/ml）、D組（150μg/ml）。致BALB/c小鼠氣道炎癥，收集各組小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）檢測細(xì)胞計數(shù)，ELISA法檢測小鼠氣道內(nèi)的IL-1β、IL-18表達(dá)水平；根據(jù)不同組細(xì)胞計數(shù)的數(shù)量及IL-1β、IL-18的表達(dá)水平的差異，選擇LMPs最佳誘導(dǎo)濃度。 1.2.2LMPs致炎模型最佳誘導(dǎo)時間的篩選 24只雌性BALB/C小鼠隨機(jī)分為4組（n=6）：正常對照組(A組）、LMPs處理12h組（B組）、24h組（C組）、48h組（D組）。在LMPs最佳誘導(dǎo)濃度下分別誘導(dǎo)小鼠0h，12h，24h，48h后，收集各組小鼠BALF檢測細(xì)胞計數(shù)，ELISA檢測各組IL-1β、IL-18表達(dá)水平；根據(jù)不同組細(xì)胞計數(shù)的數(shù)量及IL-1β、IL-18表達(dá)水平的差異，選擇LMPs最佳誘導(dǎo)時間。 1.2.3組織病理學(xué)檢測：HE染色法觀察LMPs處理后的BALB/c小鼠的支氣管和肺組織的變化情況。 2. LMPs致BALB/c小鼠氣道炎癥模型的相關(guān)指標(biāo)檢測及評價 2.1收集小鼠BALF檢測細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞吞噬功能 在LMPs最佳誘導(dǎo)濃度、最佳誘導(dǎo)時間條件下致炎小鼠氣道模型，收集小鼠BALF檢測細(xì)胞計數(shù)，檢測細(xì)胞吞噬功能。 2.2小鼠BALF中IL-1β、IL-18表達(dá)水平檢測 在LMPs最佳誘導(dǎo)濃度，最佳誘導(dǎo)時間條件下致炎小鼠氣道模型，ELISA檢測小鼠氣道內(nèi)IL-1β、IL-18，觀察處理組IL-1β、IL-18變化。 2.3相對定量PCR和Western blot檢測肺組織中NLRP3、TLR4、IL-18和IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)水平 實驗分為2組，每組4個BALB/C小鼠樣本，其中A-1， A-2，A-3，A-4為正常小鼠的肺組織，B-1，B-2，B-3，B-4表示小鼠經(jīng)過最佳誘導(dǎo)濃度的LMPS灌肺后，在最佳誘導(dǎo)時間后取材的肺組織。RT-PCR和Western blot分別檢測肺組織中NLRP3、TLR4、IL-18和IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)水平，觀察變化情況。 結(jié)果： 1. LMPs致BALB/c小鼠氣道炎癥模型的建立 1.1經(jīng)LMPs處理后小鼠BALF中細(xì)胞數(shù)量較對照組逐漸增多，20μg/ml LMPs誘導(dǎo)時輕度增高，50、150μg/m1LMPs誘導(dǎo)時細(xì)胞計數(shù)明顯增高且穩(wěn)定。正常組BALB/c小鼠氣道內(nèi)低表達(dá)IL-1β、IL-18；20μg/ml LMPs誘導(dǎo)后IL-1β、IL-18表達(dá)水平有所升高，而50、150μg/m1LMPs誘導(dǎo)時IL-1β、IL-18表達(dá)水平最高并較為穩(wěn)定。故LMPs誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥的最佳濃度為50μg/ml。 1.2在50μg/ml最佳誘導(dǎo)濃度下，小鼠BALF中細(xì)胞數(shù)量較正常組逐漸增多，12h誘導(dǎo)時輕度增高，24h、48h誘導(dǎo)時細(xì)胞計數(shù)增高且穩(wěn)定；正常組小鼠氣道內(nèi)低表達(dá)IL-1β、IL-18；LMPs誘導(dǎo)12h時產(chǎn)生的IL-1β、IL-18有所升高，LMPs誘導(dǎo)24h和48h時促炎因子IL-1β、IL-18表達(dá)最高并較為穩(wěn)定。故LMPs誘導(dǎo)最佳時間點為24h。 1.3組織病理學(xué)觀察：經(jīng)LMPs處理組小鼠肺組織中淋巴細(xì)胞顯著聚集，部分支氣管出現(xiàn)管腔纖維化、閉塞。 2. LMPs致BALB/c小鼠氣道炎癥模型的相關(guān)指標(biāo)的檢測及評價 2.1氣道炎癥模型小鼠BALF中細(xì)胞數(shù)量較正常組明顯增多(P0.01)；細(xì)胞吞噬數(shù)比正常組明顯增多(P0.01)。 2.2模型小鼠BALF中， IL-1β檢測值為45.40±0.40pg/ml，正常組為1.56±0.20pg/ml，兩組間存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)；IL-18檢測值為639.46±7.92pg/ml，而正常組為29.17±2.35pg/ml，兩組間也存在顯著差異(P0.01)。 2.3模型小鼠肺組織NLRP3、TLR4、IL-1β及IL-18mRNA表達(dá)水平較正常組均有不同程度升高，且NLRP3、TLR4mRNA上升水平更為明顯（P＜0.01）。 2.4Western blot檢測模型小鼠肺組織NLRP3、TLR4、IL-18及IL-1β蛋白質(zhì)在不同分組中的表達(dá)情況，其表達(dá)水平與mRNA水平表達(dá)趨勢相一致。 結(jié)論： 1.本研究成功建立了LMPs致BALB/c小鼠氣道炎癥模型，LMPs致小鼠氣道炎癥模型最佳誘導(dǎo)濃度為50μg/ml，最佳誘導(dǎo)時間為24h。 2.體內(nèi)實驗研究初步證實LMPs能夠引起小鼠氣道內(nèi)IL-18、IL-1β的表達(dá)升高，肺組織中淋巴細(xì)胞顯著聚集，部分支氣管出現(xiàn)管腔纖維化、閉塞；提示淋巴細(xì)胞微粒能導(dǎo)致氣道炎癥，在誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥過程中發(fā)揮著促炎的作用。 3. LMPs處理后小鼠BALF中細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞吞噬明顯增強(qiáng)；提示LMPs可能通過促進(jìn)氣道局部炎癥細(xì)胞的聚集，活化吞噬細(xì)胞而發(fā)揮致炎作用。 4. LMPs導(dǎo)致氣道炎癥發(fā)生可能是通過上調(diào)NLRP3、TLR4的表達(dá)，導(dǎo)致IL-1β、IL-18釋放過多來實現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R-332;R563.9

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳凌;甘華;;炎癥小體及其與腎臟疾病的關(guān)系[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2012年03期

2 謝利軍;解衛(wèi)平;王虹;;NLRP3炎癥小體與呼吸系統(tǒng)疾病[J];中華哮喘雜志(電子版);2013年04期

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本文編號：1179047