發(fā)布時(shí)間：2017-11-12 14:16

  本文關(guān)鍵詞：體外條件下攜帶β-catenin基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 慢病毒載體 β-聯(lián)蛋白 信號(hào)通路 急性肺損傷 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

【摘要】：背景 煙霧吸入性肺損傷(Smoke inhalation lung injury, SILI)是一種特殊類(lèi)型的急性肺損傷(acute lung injure, ALI),它是火災(zāi)中幸存的燒傷患者的主要死因。具有起病急、發(fā)展快、病情重等特點(diǎn),主要累及呼吸道、肺,病理表現(xiàn)為氣管黏膜上皮變性,纖毛消失,黏膜下充血水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及肺泡破裂融合,肺泡腔滲出、出血,肺血管內(nèi)皮壞死,血栓等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)由于其多項(xiàng)分化潛能而備受關(guān)注,多項(xiàng)研究報(bào)道在體外及體內(nèi)條件下BMSCs可增殖分化為肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells, AEC)對(duì)損傷的肺泡上皮進(jìn)行修復(fù),但其分化機(jī)制尚不清楚,且增殖效率低。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)煙霧吸入性肺損傷大鼠肺組織內(nèi)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路激活,β-catenin是此信號(hào)通路的核心成分,本研究正是在此基礎(chǔ)上,觀察β-catenin對(duì)BMSCs增殖的影響。 目的 構(gòu)建β-catenin過(guò)表達(dá)的慢病毒載體(lentiviral vector, LV),轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并進(jìn)行包裝病毒,純化病毒感染大鼠BMSCs,使得β-catenin在BMSCs內(nèi)高表達(dá),并探討β-catenin對(duì)BMSCs增殖能力的影響。 方法 1.運(yùn)用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),用CCK-8法繪制大鼠BMSCs的生長(zhǎng)曲線,并進(jìn)行成脂及成骨誘導(dǎo)分化,分別用油紅O及茜素紅對(duì)其進(jìn)行染色鑒定。 2.構(gòu)建β-catenin過(guò)表達(dá)的LV,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝,并對(duì)病毒進(jìn)行濃縮,在96孔板中進(jìn)行感染BMSCs的預(yù)實(shí)驗(yàn),明確不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)條件下,含β-catenin基因的LV的轉(zhuǎn)染效率,摸索出轉(zhuǎn)染效率較高而對(duì)細(xì)胞毒性最小的病毒濃度條件,之后分為五組：轉(zhuǎn)染含β-catenin基因的LV的BMSCs (A組：MOI=10；B組：MOI=25)、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照病毒的BMSCs(C組：MOI=10)、聚凝胺(polybrene)+BMSCs(D組)、BMSCs(E組),通過(guò)PCR檢測(cè)β-catenin在BMSCs中的表達(dá)情況,通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。 結(jié)果 1.BMSCs貼壁生長(zhǎng),呈細(xì)長(zhǎng)的紡錘形,類(lèi)似成纖維細(xì)胞外形。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S形,加入成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)72h后,細(xì)胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn),約2周后脂滴數(shù)量增加并相互融合,細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形或多邊形,油紅O染色顯示有大量脂質(zhì)沉淀。加入干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液,誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后,細(xì)胞體積增大,呈短梭形；誘導(dǎo)第7天,細(xì)胞呈多角形,胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞顆粒增多；14天,胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒,細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng),細(xì)胞間可見(jiàn)鈣質(zhì)沉積；21天,細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu),鈣結(jié)節(jié)形成明顯,經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)。 2.構(gòu)建的β-catenin LV滴度為2.00E+8TU/ml。當(dāng)MOI=25時(shí),流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染目的基因的BMSCs在轉(zhuǎn)染后96h時(shí)感染效率大約為76%。且PCR檢測(cè)到β-catenin的mRNA在BMSCs中過(guò)表達(dá)。 3.D、E兩組貼壁后,第1-2天,細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)較慢,3-5天,細(xì)胞生長(zhǎng)較快,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,之后細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢,生長(zhǎng)逐漸停滯,且兩組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。慢病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs,其生長(zhǎng)均受到抑制,與D、E組相比,從第2天開(kāi)始其生長(zhǎng)速度明顯減慢(A、B、C組分別與D組相比,組間差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.001)。C組與A、B組相比,從其生長(zhǎng)速率進(jìn)一步下降(C組分別與A、B組相比,從第3天開(kāi)始,組間開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05,第4天以后具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.001)。而A、B兩組相比,BMSCs的生長(zhǎng)速率無(wú)明顯差異。 結(jié)論 1.應(yīng)用全骨髓貼壁培養(yǎng)法成功獲得大鼠BMSCs。 2與空載對(duì)照組相比,利用慢病毒感染至β-catenin過(guò)表達(dá)可促進(jìn)大鼠BMSCs的增殖。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉然義,羅慧玲,馮海林,彭吉林,蔡體育,黃文林,曾益新;一種用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)基因轉(zhuǎn)移效率的新方法[J];癌癥;2002年03期

2 洪淵智;李娜萍;吳人亮;劉明閣;馬燕;;β-連環(huán)素及相關(guān)蛋白在脂多糖致急性肺損傷小鼠氣道上皮的表達(dá)[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年04期

3 王力;徐小紅;張寧坤;高連如;朱智明;;攜帶標(biāo)記基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];天津醫(yī)藥;2013年10期

4 龐寶森,王辰,張洪玉,安立,翁心植,牛淑潔;維A酸 β-胡蘿卜素 �；撬釋�(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性阻塞性肺氣腫的預(yù)防作用及機(jī)制探討[J];心肺血管病雜志;2004年01期

5 左克強(qiáng);錢(qián)振宇;劉杰;程杰;校宏兵;丁衛(wèi)星;;烏司他丁在腹主動(dòng)脈瘤切除術(shù)中對(duì)肺的保護(hù)作用[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年03期

6 張紅珊;方建培;蘇浩彬;楊e，

本文編號(hào)：1176246