本文關(guān)鍵詞：體外條件下攜帶β-catenin基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs的實驗研究

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【摘要】：背景 煙霧吸入性肺損傷(Smoke inhalation lung injury, SILI)是一種特殊類型的急性肺損傷(acute lung injure, ALI),它是火災(zāi)中幸存的燒傷患者的主要死因。具有起病急、發(fā)展快、病情重等特點,主要累及呼吸道、肺,病理表現(xiàn)為氣管黏膜上皮變性,纖毛消失,黏膜下充血水腫,炎性細胞浸潤以及肺泡破裂融合,肺泡腔滲出、出血,肺血管內(nèi)皮壞死,血栓等。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)由于其多項分化潛能而備受關(guān)注,多項研究報道在體外及體內(nèi)條件下BMSCs可增殖分化為肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cells, AEC)對損傷的肺泡上皮進行修復(fù),但其分化機制尚不清楚,且增殖效率低。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)煙霧吸入性肺損傷大鼠肺組織內(nèi)經(jīng)典Wnt信號通路激活,β-catenin是此信號通路的核心成分,本研究正是在此基礎(chǔ)上,觀察β-catenin對BMSCs增殖的影響。 目的 構(gòu)建β-catenin過表達的慢病毒載體(lentiviral vector, LV),轉(zhuǎn)染293T細胞并進行包裝病毒,純化病毒感染大鼠BMSCs,使得β-catenin在BMSCs內(nèi)高表達,并探討β-catenin對BMSCs增殖能力的影響。 方法 1.運用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs,在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),用CCK-8法繪制大鼠BMSCs的生長曲線,并進行成脂及成骨誘導(dǎo)分化,分別用油紅O及茜素紅對其進行染色鑒定。 2.構(gòu)建β-catenin過表達的LV,轉(zhuǎn)染293T細胞進行病毒包裝,并對病毒進行濃縮,在96孔板中進行感染BMSCs的預(yù)實驗,明確不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)條件下,含β-catenin基因的LV的轉(zhuǎn)染效率,摸索出轉(zhuǎn)染效率較高而對細胞毒性最小的病毒濃度條件,之后分為五組：轉(zhuǎn)染含β-catenin基因的LV的BMSCs (A組：MOI=10；B組：MOI=25)、轉(zhuǎn)染陰性對照病毒的BMSCs(C組：MOI=10)、聚凝胺(polybrene)+BMSCs(D組)、BMSCs(E組),通過PCR檢測β-catenin在BMSCs中的表達情況,通過CCK-8法檢測細胞增殖活力。 結(jié)果 1.BMSCs貼壁生長,呈細長的紡錘形,類似成纖維細胞外形。細胞生長曲線呈S形,加入成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)72h后,細胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn),約2周后脂滴數(shù)量增加并相互融合,細胞由長梭形變?yōu)閳A形或多邊形,油紅O染色顯示有大量脂質(zhì)沉淀。加入干細胞成骨誘導(dǎo)液,誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后,細胞體積增大,呈短梭形；誘導(dǎo)第7天,細胞呈多角形,胞質(zhì)內(nèi)細胞顆粒增多；14天,胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒,細胞呈集落樣生長,細胞間可見鈣質(zhì)沉積；21天,細胞結(jié)節(jié)中心的細胞逐漸融合失去細胞結(jié)構(gòu),鈣結(jié)節(jié)形成明顯,經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)。 2.構(gòu)建的β-catenin LV滴度為2.00E+8TU/ml。當MOI=25時,流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染目的基因的BMSCs在轉(zhuǎn)染后96h時感染效率大約為76%。且PCR檢測到β-catenin的mRNA在BMSCs中過表達。 3.D、E兩組貼壁后,第1-2天,細胞生長相對較慢,3-5天,細胞生長較快,進入對數(shù)生長期,之后細胞生長速度減慢,生長逐漸停滯,且兩組之間無明顯差異(P0.05)。慢病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs,其生長均受到抑制,與D、E組相比,從第2天開始其生長速度明顯減慢(A、B、C組分別與D組相比,組間差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義,P0.001)。C組與A、B組相比,從其生長速率進一步下降(C組分別與A、B組相比,從第3天開始,組間開始出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05,第4天以后具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義,P0.001)。而A、B兩組相比,BMSCs的生長速率無明顯差異。 結(jié)論 1.應(yīng)用全骨髓貼壁培養(yǎng)法成功獲得大鼠BMSCs。 2與空載對照組相比,利用慢病毒感染至β-catenin過表達可促進大鼠BMSCs的增殖。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R563.8

【參考文獻】

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本文編號：1176246