本文關(guān)鍵詞：氣管內(nèi)注射TSLP中和抗體抑制哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性研究

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【摘要】：研究背景 支氣管哮喘是由多因素引起的,以氣道高反應(yīng)性(AHR)、氣道炎癥和可逆性氣道阻塞為特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病。目前全世界約有三億患者,中國(guó)至少有近3000萬(wàn)哮喘患者。據(jù)WHO估計(jì),隨著氣候變暖,全球每年死于支氣管哮喘和過(guò)敏癥的患者有25萬(wàn),而且近期哮喘的死亡率在世界范圍內(nèi)均呈上升趨勢(shì)。近二十年來(lái)全球哮喘患病率不斷上升,大約每年以1%的速度遞增,其中以兒童患病率上升最為顯著。哮喘的發(fā)病機(jī)制繁雜廣泛,目前認(rèn)為是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病,表現(xiàn)為多種炎癥細(xì)胞特別是嗜酸粒細(xì)胞(EOS)、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等在氣道的浸潤(rùn)及聚集,并分泌多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子。目前仍缺乏根治哮喘的方法,現(xiàn)有的治療藥物包括支氣管擴(kuò)張劑、糖皮質(zhì)激素、兩者的聯(lián)合制劑(舒利迭、信必可)、白三烯調(diào)節(jié)劑、長(zhǎng)效膽堿能受體拮抗劑(噻托溴胺)、IgE抗體等,但是仍然不能控制所有哮喘患者病情。另外,治療不規(guī)范或者僅針對(duì)控制癥狀的治療,造成哮喘控制良好的比率很低歐美國(guó)家只有30%,中國(guó)卻低于10%。另外值得需注意的是,現(xiàn)有治療方案的局限性和存在的不良反應(yīng),如激素對(duì)機(jī)體的免疫抑制缺乏針對(duì)性,長(zhǎng)期使用激素可造成骨質(zhì)疏松、高血糖、二重感染。最新研究發(fā)現(xiàn)吸入性糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用可以增加肺炎的發(fā)病率；支氣管擴(kuò)張劑、白三烯調(diào)節(jié)劑針對(duì)氣道炎癥的下游的某個(gè)環(huán)節(jié),不良反應(yīng)包括低血鉀、心動(dòng)過(guò)速、心律不齊、震顫等。這些不盡人意的地方都促使我們進(jìn)一步研究哮喘的發(fā)病機(jī)制,尋求更好更有效的哮喘控制甚至治愈方法。 氣道炎癥是所有類型哮喘的共同特征,是哮喘氣道高反應(yīng)性和其他臨床癥狀的病理基礎(chǔ),也是應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的理論基石。而氣道炎癥的形成機(jī)制是極其復(fù)雜的,糖皮質(zhì)激素應(yīng)用的靶點(diǎn)也是多方位的,不免會(huì)產(chǎn)生不必要的抑制甚至是副作用。近期研究發(fā)現(xiàn)胸腺基質(zhì)淋巴生成素(Thymic Stromal Lymphopoietin,TSLP)在過(guò)敏性炎癥包括哮喘炎癥形成中具有重要地位。以往的研究關(guān)于靶向抑制氣道上皮細(xì)胞表達(dá)TSLP來(lái)控制哮喘炎癥的文章較少,尚無(wú)文章系統(tǒng)闡述抑制TSLP對(duì)于下游Th細(xì)胞分化方向的影響。因此,本實(shí)驗(yàn)利用OVA反復(fù)致敏激發(fā)構(gòu)建哮喘小鼠動(dòng)物模型,通過(guò)氣道內(nèi)直接注射TSLP中和抗體的方法,試圖從降低支氣管黏膜氣道上皮細(xì)胞表面TSLP水平,從源頭上改變炎癥啟動(dòng)的微環(huán)境為研究切入點(diǎn),觀察Th1、Th2、Treg細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、Foxp3的表達(dá)情況,以及檢測(cè)哮喘小鼠氣道反應(yīng)性、分析肺組織氣道炎癥的變化,來(lái)初步探討TSLP在哮喘炎癥發(fā)展過(guò)程中的重要作用,探索TSLP-TSLPR下游通路,并嘗試找到可用于臨床的控制哮喘發(fā)病、炎癥進(jìn)展的新方法。[TSLP、TSLPR在過(guò)敏性哮喘炎癥形成中的作用] TSLP是一種上皮細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子,可在皮膚、腸、肺和胸腺表達(dá)。在哮喘患者支氣管上皮細(xì)胞、過(guò)敏性皮炎患者角化細(xì)胞中均可觀察到大量TSLP的表達(dá)。新近研究表明,TSLP在哮喘發(fā)病機(jī)制中通過(guò)幾個(gè)不同的途徑發(fā)揮重要的致炎作用,TSLP不僅通過(guò)激活骨髓源樹突狀細(xì)胞(DC),影響DCs與幼稚Th0細(xì)胞的相互作用,造成有利于Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞極化的微環(huán)境,使Th0細(xì)胞偏向Th2方向分化,進(jìn)而產(chǎn)生大量Th2型細(xì)胞因子導(dǎo)致過(guò)敏性炎癥。而且TSLP誘導(dǎo)的DCs與其他通路激活的DCs不同,它不促進(jìn)Thl型細(xì)胞因子的產(chǎn)生；TSLP或直接作用于激活的CD4+T細(xì)胞加強(qiáng)Th2型過(guò)敏炎癥；TSLP作用于肥大細(xì)胞引起Th2型細(xì)胞因子增多,從而介導(dǎo)一個(gè)不需要T細(xì)胞參與的途徑來(lái)發(fā)揮其促炎癥作用；而且,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TSLP可以直接啟動(dòng)Th2分化,即使是沒有DCs存在：用TSLP處理初始CD4+T細(xì)胞,同時(shí)刺激T細(xì)胞受體(TCR)可以導(dǎo)致IL-4的產(chǎn)生及Th2方向分化。 TSLP受體(TSLPR)屬于造血因子受體家族成員,為Ⅰ型細(xì)胞因子受體蛋白。TSLPR只有與IL-7受體α鏈(IL-7Rα)共同作用時(shí)才可形成高親和力的受體復(fù)合物,其本身與TSLP親和力非常低。TSLPR基因敲除小鼠OVA刺激后,幾乎未出現(xiàn)杯狀細(xì)胞增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的情況,BALF中IL-4含量和肺組織中的IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ的mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化。Balb/c小鼠肺特異性表達(dá)TSLP的轉(zhuǎn)基因小鼠模型實(shí)驗(yàn)顯示,小鼠氣道表現(xiàn)為明顯杯狀細(xì)胞增生、粒細(xì)胞浸潤(rùn)和黏膜下纖維化,伴明顯的氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥,Th2型細(xì)胞因子和IgE水平的顯著增加。新近研究發(fā)現(xiàn),糖皮質(zhì)激素可降低哮喘鼠TSLP、TSLPR的表達(dá),可改變TSLP誘導(dǎo)的DC功能,使抗原誘導(dǎo)Th2反應(yīng)朝Thl反應(yīng)偏移,IL-4、IL-5、IL-13減少,產(chǎn)生IL-10和IFN-γ增加,此作用依賴于DC中OX40L的下調(diào)以及IL-12產(chǎn)量增加。哮喘患者的研究數(shù)據(jù)表明,哮喘氣道炎癥的嚴(yán)重程度與TSLP的表達(dá)水平呈正相關(guān)。 綜上所述,TSLP-TSLPR及下游信號(hào)分子對(duì)過(guò)敏性炎癥疾病(如過(guò)敏性哮喘)的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程具有重要作用。[Th2亢進(jìn),Thl/Th2失衡,Treg抑制] 輔助T細(xì)胞(T helper cells)在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用�；罨疌D4+T細(xì)胞按其功能和分泌的細(xì)胞因子的不同可分為Thl、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等多個(gè)細(xì)胞亞群,其中Thl、Th2是兩種相互制約的效應(yīng)細(xì)胞類型。CD4+CD25+Foxp+Treg細(xì)胞常執(zhí)行抑制哮喘炎癥作用,是T細(xì)胞中執(zhí)行炎癥控制的重要執(zhí)行者。Th1、Th2、Treg細(xì)胞亞群分化分別受它們各自特異的轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、Foxp3調(diào)控,三者相互作用共同決定Th0的分化趨勢(shì)。而TSLP過(guò)度表達(dá)可能是引起哮喘Thl/Th2失衡和氣道慢性炎癥的重要原因。另外,TSLP過(guò)度表達(dá)還可以導(dǎo)致Treg細(xì)胞的功能下降。諸多研究表明,Th2亢進(jìn),Th1、Th2失衡是哮喘慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。哮喘患者BALF中Treg細(xì)胞功能受到抑制,糖皮質(zhì)激素治療后,受抑制的Treg細(xì)胞功能恢復(fù)。 經(jīng)典的Thl型細(xì)胞主要分泌γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素2(IL-2),還具有活化巨噬細(xì)胞和引起細(xì)胞毒作用,過(guò)分的Thl激活將會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞自體免疫疾病比如麻風(fēng)病或結(jié)核菌素過(guò)分反應(yīng)；Th2細(xì)胞主要分泌的IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子可輔助B細(xì)胞促進(jìn)IgE生成、EOS等炎癥細(xì)胞分化、募集、活化和粘液的高分泌,可介導(dǎo)包括支氣管哮喘在內(nèi)的過(guò)敏性疾病的發(fā)生發(fā)展。CD4+T細(xì)胞分泌的Th2細(xì)胞因子與哮喘AHR、氣道EOS浸潤(rùn)和活化及血清IgE增高顯著相關(guān)。變應(yīng)性哮喘患者血清、外周血、BALF、支氣管和外周小氣道粘膜中存在以IL-4、IL-5為主的Th2優(yōu)勢(shì)反應(yīng),且IL-4/IFN-γ,、IL-5血清水平的升高與哮喘嚴(yán)重程度相關(guān),并隨有效治療后下降。過(guò)敏性哮喘的標(biāo)志是由Th2細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。另外,近來(lái)研究表明Treg細(xì)胞的數(shù)量不足或功能缺陷與哮喘的發(fā)病、過(guò)敏性氣道炎癥密切相關(guān)。Treg細(xì)胞主要分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10,TGF-β或直接細(xì)胞接觸發(fā)揮炎癥抑制和誘導(dǎo)免疫耐受、維持機(jī)體自身穩(wěn)定的作用。Th17是近年發(fā)現(xiàn)的新亞群,主要分泌IL17、IL22等促炎癥因子,RORγ是其重要的轉(zhuǎn)錄因子。Thl7細(xì)胞在自身免疫中起重要的作用。 對(duì)于CD4+CD25淋巴細(xì)胞,hTSLP-DCs可以誘導(dǎo)它們分化成為CD4+CD8-CD25+Tregs細(xì)胞,Foxp3mRNA表達(dá)水平同自然體內(nèi)的Treg細(xì)胞相同。另外的證據(jù)表面,在幼鼠胸腺組織模型中,mTSLP促進(jìn)Foxp3和CD4+CD8-CD25+Tregs細(xì)胞表達(dá),阻斷mTSLPR后這一表達(dá)被抑制。但是,TSLPR缺陷的鼠并未表現(xiàn)Treg細(xì)胞生成的異常。這可能是由于種屬差異,但是關(guān)于TSLP抗體處理后對(duì)于其肺部Foxp3的表達(dá)情況尚不明朗。 可見,TSLP來(lái)源廣泛,作用靶點(diǎn)分布廣泛。TSLP可作用于上皮細(xì)胞、DCs、Th細(xì)胞、肥大細(xì)胞等產(chǎn)生各種細(xì)胞因子與趨化因子,形成傾向于Th2細(xì)胞的微環(huán)境,改變Thl/Th2比例,直接或者間接抑制Treg細(xì)胞功能,從而影響哮喘整個(gè)過(guò)敏性炎癥的發(fā)展方向,促進(jìn)哮喘過(guò)敏性炎癥的形成。因此,我們推測(cè)通過(guò)氣道內(nèi)直接注射TSLP中和抗體,可以直接降低支氣管黏膜氣道上皮細(xì)胞表面TSLP水平,從而從源頭上改變炎癥啟動(dòng)的微環(huán)境,也即通過(guò)改變整個(gè)過(guò)敏性炎癥的“基調(diào)”,來(lái)達(dá)到緩解哮喘炎癥程度的目的,這有可能成為控制哮喘的一種新 方法。 研究目的 本研究旨在通過(guò)氣道內(nèi)注射TSLP中和抗體,以造成氣道上皮微環(huán)境的改變,觀察小鼠肺功能、氣道炎癥程度、小鼠肺組織中TSLP、TSLPR和轉(zhuǎn)錄因子T-be、GATA3、Foxp3的mRNA基因表達(dá)的變化。探究TSLP在哮喘發(fā)病中的作用和途徑,明確TSLP-TSLPR通路對(duì)下游Th0細(xì)胞分化方向影響。 研究對(duì)象及方法 1、將41只SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠分組隨機(jī)分成四組：正常對(duì)照組、哮喘組、對(duì)照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組、anti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組。每組9-11只。 2、哮喘組、對(duì)照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組、anti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組均采用1,7,14d反復(fù)腹腔注射OVA/Al(OH)3致敏,21、24d氣道注射藥物干預(yù),24d氣道注射結(jié)束2h后開始OVA溶液滴鼻(24、25、26d)+霧化吸入(27、28d)激發(fā)的方法建立Balb/c小鼠OVA致敏哮喘模型及其哮喘干預(yù)模型。正常對(duì)照組致敏、激發(fā)藥物均為相同體積生理鹽水(NS)。 3、正常對(duì)照組、哮喘組的干預(yù)藥物為NS,對(duì)照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組的干預(yù)藥物為IgG2a mAb對(duì)照抗體, anti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組的干預(yù)藥物為TSLP中和抗體。 4、OVA激發(fā)后應(yīng)用Buxco無(wú)創(chuàng)肺功能系統(tǒng)檢測(cè)小鼠氣道阻力；根據(jù)Underwood抗原激發(fā)肺部炎癥改變的組織病理學(xué)評(píng)分系統(tǒng)對(duì)小鼠肺部炎癥情況進(jìn)行評(píng)分；熒光定量PCR檢測(cè)小鼠肺部TSLP、SLPR和轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、Foxp3的mRNA相對(duì)表達(dá)量。 研究結(jié)果 1、小鼠無(wú)創(chuàng)肺功能Penh值結(jié)果：哮喘組和對(duì)照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組的Penh值顯著高于正常對(duì)照組(p均0.001),前兩組Penh值無(wú)顯著差異(P0.05)；與哮喘組和對(duì)照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組相比,anti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組的Penh值顯著降低(p均0.001),高于正常對(duì)照組(P=0.044) 2、哮喘小鼠肺部病理切片HE染色結(jié)果：哮喘組的炎癥評(píng)分(3.2727±1.4206)、對(duì)照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組(3.5000±1.2693)的炎癥評(píng)分均顯著高于正常對(duì)照組(0.4545±0.5222)(P均0.01),前兩組之間無(wú)顯著差異(P0.05)；與哮喘組和對(duì)照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組相比,anti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組(1.2222±0.9718)的炎癥評(píng)分顯著降低(P均0.05),與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P0.05)。 3、炎癥介質(zhì)及轉(zhuǎn)錄因子基因熒光定量PCR結(jié)果： (1)小鼠肺部TSLP：哮喘組和對(duì)照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組肺組織TSLPmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組(P均0.05),前兩組之間無(wú)顯著差異(P0.05)；與哮喘組和對(duì)照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組相比,nti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組的TSLP mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P均0.05),與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P0.05)。 (2)小鼠肺部TSLPR:正常對(duì)照組的肺組織TSLPR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于哮喘組、對(duì)照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組和anti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組(P均0.05)；后三組間肺組織TSLPR mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P均0.05)。 (3)小鼠肺部T-bet：四組間肺組織T-bet mRNA相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著差異(P0.05)。 (4)小鼠肺部GATA3：哮喘組和對(duì)照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組的肺組織GATA3mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組(P均0.05),前兩組之間無(wú)顯著差異(P0.05)；與哮喘組和對(duì)照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組相比,nti-TSLPmAb干預(yù)哮喘組的GATA3mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P均0.05),與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P0.05) (5)小鼠肺部Foxp3：四組間肺組織Foxp3mRNA相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著差異(P0.05)。結(jié)論 1、以Penh值作為氣道反應(yīng)性的測(cè)定指標(biāo),與正常對(duì)照組比較,OVA致敏激發(fā)哮喘組的Penh值明顯升高,氣管內(nèi)注射TSLP中和抗體可以降低哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性。 2、OVA致敏激發(fā)哮喘小鼠的氣道炎癥及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度比正常對(duì)照小鼠的嚴(yán)重,氣道內(nèi)注射TSLP中和抗體可以減輕哮喘小鼠氣道炎癥程度及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。 3、與正常對(duì)照組比較,OVA致敏激發(fā)哮喘組小鼠肺組織TSLP、TSLPR、 GATA3的RNA基因表達(dá)水平升高,氣道內(nèi)注射TSLP中和抗體可顯著降低哮喘小鼠肺部TSLP、GATA3的mRNA基因表達(dá)水平。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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本文編號(hào)：1169993