本文關(guān)鍵詞：氣管內(nèi)注射TSLP中和抗體抑制哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性研究

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【摘要】：研究背景 支氣管哮喘是由多因素引起的,以氣道高反應(yīng)性(AHR)、氣道炎癥和可逆性氣道阻塞為特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病。目前全世界約有三億患者,中國至少有近3000萬哮喘患者。據(jù)WHO估計,隨著氣候變暖,全球每年死于支氣管哮喘和過敏癥的患者有25萬,而且近期哮喘的死亡率在世界范圍內(nèi)均呈上升趨勢。近二十年來全球哮喘患病率不斷上升,大約每年以1%的速度遞增,其中以兒童患病率上升最為顯著。哮喘的發(fā)病機制繁雜廣泛,目前認為是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病,表現(xiàn)為多種炎癥細胞特別是嗜酸粒細胞(EOS)、肥大細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞、嗜堿性粒細胞等在氣道的浸潤及聚集,并分泌多種炎性介質(zhì)和細胞因子。目前仍缺乏根治哮喘的方法,現(xiàn)有的治療藥物包括支氣管擴張劑、糖皮質(zhì)激素、兩者的聯(lián)合制劑(舒利迭、信必可)、白三烯調(diào)節(jié)劑、長效膽堿能受體拮抗劑(噻托溴胺)、IgE抗體等,但是仍然不能控制所有哮喘患者病情。另外,治療不規(guī)范或者僅針對控制癥狀的治療,造成哮喘控制良好的比率很低歐美國家只有30%,中國卻低于10%。另外值得需注意的是,現(xiàn)有治療方案的局限性和存在的不良反應(yīng),如激素對機體的免疫抑制缺乏針對性,長期使用激素可造成骨質(zhì)疏松、高血糖、二重感染。最新研究發(fā)現(xiàn)吸入性糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用可以增加肺炎的發(fā)病率；支氣管擴張劑、白三烯調(diào)節(jié)劑針對氣道炎癥的下游的某個環(huán)節(jié),不良反應(yīng)包括低血鉀、心動過速、心律不齊、震顫等。這些不盡人意的地方都促使我們進一步研究哮喘的發(fā)病機制,尋求更好更有效的哮喘控制甚至治愈方法。 氣道炎癥是所有類型哮喘的共同特征,是哮喘氣道高反應(yīng)性和其他臨床癥狀的病理基礎(chǔ),也是應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的理論基石。而氣道炎癥的形成機制是極其復(fù)雜的,糖皮質(zhì)激素應(yīng)用的靶點也是多方位的,不免會產(chǎn)生不必要的抑制甚至是副作用。近期研究發(fā)現(xiàn)胸腺基質(zhì)淋巴生成素(Thymic Stromal Lymphopoietin,TSLP)在過敏性炎癥包括哮喘炎癥形成中具有重要地位。以往的研究關(guān)于靶向抑制氣道上皮細胞表達TSLP來控制哮喘炎癥的文章較少,尚無文章系統(tǒng)闡述抑制TSLP對于下游Th細胞分化方向的影響。因此,本實驗利用OVA反復(fù)致敏激發(fā)構(gòu)建哮喘小鼠動物模型,通過氣道內(nèi)直接注射TSLP中和抗體的方法,試圖從降低支氣管黏膜氣道上皮細胞表面TSLP水平,從源頭上改變炎癥啟動的微環(huán)境為研究切入點,觀察Th1、Th2、Treg細胞的重要轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、Foxp3的表達情況,以及檢測哮喘小鼠氣道反應(yīng)性、分析肺組織氣道炎癥的變化,來初步探討TSLP在哮喘炎癥發(fā)展過程中的重要作用,探索TSLP-TSLPR下游通路,并嘗試找到可用于臨床的控制哮喘發(fā)病、炎癥進展的新方法。[TSLP、TSLPR在過敏性哮喘炎癥形成中的作用] TSLP是一種上皮細胞衍生的細胞因子,可在皮膚、腸、肺和胸腺表達。在哮喘患者支氣管上皮細胞、過敏性皮炎患者角化細胞中均可觀察到大量TSLP的表達。新近研究表明,TSLP在哮喘發(fā)病機制中通過幾個不同的途徑發(fā)揮重要的致炎作用,TSLP不僅通過激活骨髓源樹突狀細胞(DC),影響DCs與幼稚Th0細胞的相互作用,造成有利于Th0細胞向Th2細胞極化的微環(huán)境,使Th0細胞偏向Th2方向分化,進而產(chǎn)生大量Th2型細胞因子導(dǎo)致過敏性炎癥。而且TSLP誘導(dǎo)的DCs與其他通路激活的DCs不同,它不促進Thl型細胞因子的產(chǎn)生；TSLP或直接作用于激活的CD4+T細胞加強Th2型過敏炎癥；TSLP作用于肥大細胞引起Th2型細胞因子增多,從而介導(dǎo)一個不需要T細胞參與的途徑來發(fā)揮其促炎癥作用；而且,實驗發(fā)現(xiàn)TSLP可以直接啟動Th2分化,即使是沒有DCs存在：用TSLP處理初始CD4+T細胞,同時刺激T細胞受體(TCR)可以導(dǎo)致IL-4的產(chǎn)生及Th2方向分化。 TSLP受體(TSLPR)屬于造血因子受體家族成員,為Ⅰ型細胞因子受體蛋白。TSLPR只有與IL-7受體α鏈(IL-7Rα)共同作用時才可形成高親和力的受體復(fù)合物,其本身與TSLP親和力非常低。TSLPR基因敲除小鼠OVA刺激后,幾乎未出現(xiàn)杯狀細胞增生和炎癥細胞浸潤的情況,BALF中IL-4含量和肺組織中的IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ的mRNA表達無顯著變化。Balb/c小鼠肺特異性表達TSLP的轉(zhuǎn)基因小鼠模型實驗顯示,小鼠氣道表現(xiàn)為明顯杯狀細胞增生、粒細胞浸潤和黏膜下纖維化,伴明顯的氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥,Th2型細胞因子和IgE水平的顯著增加。新近研究發(fā)現(xiàn),糖皮質(zhì)激素可降低哮喘鼠TSLP、TSLPR的表達,可改變TSLP誘導(dǎo)的DC功能,使抗原誘導(dǎo)Th2反應(yīng)朝Thl反應(yīng)偏移,IL-4、IL-5、IL-13減少,產(chǎn)生IL-10和IFN-γ增加,此作用依賴于DC中OX40L的下調(diào)以及IL-12產(chǎn)量增加。哮喘患者的研究數(shù)據(jù)表明,哮喘氣道炎癥的嚴重程度與TSLP的表達水平呈正相關(guān)。 綜上所述,TSLP-TSLPR及下游信號分子對過敏性炎癥疾病(如過敏性哮喘)的發(fā)生及發(fā)展過程具有重要作用。[Th2亢進,Thl/Th2失衡,Treg抑制] 輔助T細胞(T helper cells)在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。活化CD4+T細胞按其功能和分泌的細胞因子的不同可分為Thl、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)等多個細胞亞群,其中Thl、Th2是兩種相互制約的效應(yīng)細胞類型。CD4+CD25+Foxp+Treg細胞常執(zhí)行抑制哮喘炎癥作用,是T細胞中執(zhí)行炎癥控制的重要執(zhí)行者。Th1、Th2、Treg細胞亞群分化分別受它們各自特異的轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、Foxp3調(diào)控,三者相互作用共同決定Th0的分化趨勢。而TSLP過度表達可能是引起哮喘Thl/Th2失衡和氣道慢性炎癥的重要原因。另外,TSLP過度表達還可以導(dǎo)致Treg細胞的功能下降。諸多研究表明,Th2亢進,Th1、Th2失衡是哮喘慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。哮喘患者BALF中Treg細胞功能受到抑制,糖皮質(zhì)激素治療后,受抑制的Treg細胞功能恢復(fù)。 經(jīng)典的Thl型細胞主要分泌γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素2(IL-2),還具有活化巨噬細胞和引起細胞毒作用,過分的Thl激活將會導(dǎo)致巨噬細胞自體免疫疾病比如麻風病或結(jié)核菌素過分反應(yīng)；Th2細胞主要分泌的IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子可輔助B細胞促進IgE生成、EOS等炎癥細胞分化、募集、活化和粘液的高分泌,可介導(dǎo)包括支氣管哮喘在內(nèi)的過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展。CD4+T細胞分泌的Th2細胞因子與哮喘AHR、氣道EOS浸潤和活化及血清IgE增高顯著相關(guān)。變應(yīng)性哮喘患者血清、外周血、BALF、支氣管和外周小氣道粘膜中存在以IL-4、IL-5為主的Th2優(yōu)勢反應(yīng),且IL-4/IFN-γ,、IL-5血清水平的升高與哮喘嚴重程度相關(guān),并隨有效治療后下降。過敏性哮喘的標志是由Th2細胞驅(qū)動的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。另外,近來研究表明Treg細胞的數(shù)量不足或功能缺陷與哮喘的發(fā)病、過敏性氣道炎癥密切相關(guān)。Treg細胞主要分泌抑制性細胞因子IL-10,TGF-β或直接細胞接觸發(fā)揮炎癥抑制和誘導(dǎo)免疫耐受、維持機體自身穩(wěn)定的作用。Th17是近年發(fā)現(xiàn)的新亞群,主要分泌IL17、IL22等促炎癥因子,RORγ是其重要的轉(zhuǎn)錄因子。Thl7細胞在自身免疫中起重要的作用。 對于CD4+CD25淋巴細胞,hTSLP-DCs可以誘導(dǎo)它們分化成為CD4+CD8-CD25+Tregs細胞,Foxp3mRNA表達水平同自然體內(nèi)的Treg細胞相同。另外的證據(jù)表面,在幼鼠胸腺組織模型中,mTSLP促進Foxp3和CD4+CD8-CD25+Tregs細胞表達,阻斷mTSLPR后這一表達被抑制。但是,TSLPR缺陷的鼠并未表現(xiàn)Treg細胞生成的異常。這可能是由于種屬差異,但是關(guān)于TSLP抗體處理后對于其肺部Foxp3的表達情況尚不明朗。 可見,TSLP來源廣泛,作用靶點分布廣泛。TSLP可作用于上皮細胞、DCs、Th細胞、肥大細胞等產(chǎn)生各種細胞因子與趨化因子,形成傾向于Th2細胞的微環(huán)境,改變Thl/Th2比例,直接或者間接抑制Treg細胞功能,從而影響哮喘整個過敏性炎癥的發(fā)展方向,促進哮喘過敏性炎癥的形成。因此,我們推測通過氣道內(nèi)直接注射TSLP中和抗體,可以直接降低支氣管黏膜氣道上皮細胞表面TSLP水平,從而從源頭上改變炎癥啟動的微環(huán)境,也即通過改變整個過敏性炎癥的“基調(diào)”,來達到緩解哮喘炎癥程度的目的,這有可能成為控制哮喘的一種新 方法。 研究目的 本研究旨在通過氣道內(nèi)注射TSLP中和抗體,以造成氣道上皮微環(huán)境的改變,觀察小鼠肺功能、氣道炎癥程度、小鼠肺組織中TSLP、TSLPR和轉(zhuǎn)錄因子T-be、GATA3、Foxp3的mRNA基因表達的變化。探究TSLP在哮喘發(fā)病中的作用和途徑,明確TSLP-TSLPR通路對下游Th0細胞分化方向影響。 研究對象及方法 1、將41只SPF級Balb/c雌性小鼠分組隨機分成四組：正常對照組、哮喘組、對照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組、anti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組。每組9-11只。 2、哮喘組、對照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組、anti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組均采用1,7,14d反復(fù)腹腔注射OVA/Al(OH)3致敏,21、24d氣道注射藥物干預(yù),24d氣道注射結(jié)束2h后開始OVA溶液滴鼻(24、25、26d)+霧化吸入(27、28d)激發(fā)的方法建立Balb/c小鼠OVA致敏哮喘模型及其哮喘干預(yù)模型。正常對照組致敏、激發(fā)藥物均為相同體積生理鹽水(NS)。 3、正常對照組、哮喘組的干預(yù)藥物為NS,對照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組的干預(yù)藥物為IgG2a mAb對照抗體, anti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組的干預(yù)藥物為TSLP中和抗體。 4、OVA激發(fā)后應(yīng)用Buxco無創(chuàng)肺功能系統(tǒng)檢測小鼠氣道阻力；根據(jù)Underwood抗原激發(fā)肺部炎癥改變的組織病理學(xué)評分系統(tǒng)對小鼠肺部炎癥情況進行評分；熒光定量PCR檢測小鼠肺部TSLP、SLPR和轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、Foxp3的mRNA相對表達量。 研究結(jié)果 1、小鼠無創(chuàng)肺功能Penh值結(jié)果：哮喘組和對照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組的Penh值顯著高于正常對照組(p均0.001),前兩組Penh值無顯著差異(P0.05)；與哮喘組和對照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組相比,anti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組的Penh值顯著降低(p均0.001),高于正常對照組(P=0.044) 2、哮喘小鼠肺部病理切片HE染色結(jié)果：哮喘組的炎癥評分(3.2727±1.4206)、對照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組(3.5000±1.2693)的炎癥評分均顯著高于正常對照組(0.4545±0.5222)(P均0.01),前兩組之間無顯著差異(P0.05)；與哮喘組和對照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組相比,anti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組(1.2222±0.9718)的炎癥評分顯著降低(P均0.05),與正常對照組相比無顯著差異(P0.05)。 3、炎癥介質(zhì)及轉(zhuǎn)錄因子基因熒光定量PCR結(jié)果： (1)小鼠肺部TSLP：哮喘組和對照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組肺組織TSLPmRNA相對表達量顯著高于正常對照組(P均0.05),前兩組之間無顯著差異(P0.05)；與哮喘組和對照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組相比,nti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組的TSLP mRNA相對表達量顯著降低(P均0.05),與正常對照組相比無顯著差異(P0.05)。 (2)小鼠肺部TSLPR:正常對照組的肺組織TSLPR mRNA相對表達量顯著低于哮喘組、對照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組和anti-TSLP mAb干預(yù)哮喘組(P均0.05)；后三組間肺組織TSLPR mRNA相對表達量無顯著差異(P均0.05)。 (3)小鼠肺部T-bet：四組間肺組織T-bet mRNA相對表達量均無顯著差異(P0.05)。 (4)小鼠肺部GATA3：哮喘組和對照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組的肺組織GATA3mRNA相對表達量顯著高于正常對照組(P均0.05),前兩組之間無顯著差異(P0.05)；與哮喘組和對照IgG2a mAb干預(yù)哮喘組相比,nti-TSLPmAb干預(yù)哮喘組的GATA3mRNA相對表達量顯著降低(P均0.05),與正常對照組相比無顯著差異(P0.05) (5)小鼠肺部Foxp3：四組間肺組織Foxp3mRNA相對表達量均無顯著差異(P0.05)。結(jié)論 1、以Penh值作為氣道反應(yīng)性的測定指標,與正常對照組比較,OVA致敏激發(fā)哮喘組的Penh值明顯升高,氣管內(nèi)注射TSLP中和抗體可以降低哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性。 2、OVA致敏激發(fā)哮喘小鼠的氣道炎癥及嗜酸性粒細胞浸潤程度比正常對照小鼠的嚴重,氣道內(nèi)注射TSLP中和抗體可以減輕哮喘小鼠氣道炎癥程度及嗜酸性粒細胞浸潤。 3、與正常對照組比較,OVA致敏激發(fā)哮喘組小鼠肺組織TSLP、TSLPR、 GATA3的RNA基因表達水平升高,氣道內(nèi)注射TSLP中和抗體可顯著降低哮喘小鼠肺部TSLP、GATA3的mRNA基因表達水平。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：1169993