本文關(guān)鍵詞：COPD與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)性研究

  更多相關(guān)文章： COPD 動(dòng)物模型 myh14 EMT CSE

【摘要】：目的:慢性阻塞性肺疾病(COPD)是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)慢性病,具有高患病率及高死亡率等特點(diǎn),其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可能與多個(gè)基因變異相關(guān),動(dòng)物模型的建立與研究對(duì)了解其發(fā)病機(jī)制尤為重要。本研究旨在探索并構(gòu)建新的小鼠COPD模型,并從小鼠一般狀況、肺組織病理變化等多個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。對(duì)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)志物(E-cadherin、α-SMA及collagen I)在COPD模型組及對(duì)照組中表達(dá)情況進(jìn)行觀察,并進(jìn)行半定量PCR,初步篩選出與COPD相關(guān)的候選基因。在小鼠COPD模型、香煙煙霧提取物(CSE)刺激的人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)及相應(yīng)對(duì)照組中通過(guò)定量PCR、Dot bolt、Western blot及免疫熒光等檢查,研究該候選基因在其中的表達(dá)情況;對(duì)myh14在COPD的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用進(jìn)行探討,為將來(lái)進(jìn)一步研究其在COPD中的具體作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。方法:1、通過(guò)采用CSE聯(lián)合脂多糖(LPS)滴鼻建立小鼠COPD模型,將20只雄性C57/BL6小鼠隨機(jī)平均分為正常對(duì)照組及COPD模型組,于建模第42天同時(shí)處死小鼠,每組隨機(jī)選取6只小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、觀察對(duì)照組及模型組的一般情況、肺組織病理變化(HE染色、PAS染色)、肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)及肺泡破壞指數(shù)(DI),免疫組化觀察EMT表現(xiàn)。3、對(duì)支氣管肺泡灌洗液(BALF)進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)觀察。4、用兩組小鼠肺組織作為標(biāo)本進(jìn)行半定量PCR初步篩選出與COPD相關(guān)的候選基因。5、用定量PCR、Dot blot檢測(cè)篩選出的候選基因(myh14)在小鼠肺組織中m RNA及蛋白表達(dá)水平。6、MTT法選擇細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中最適CSE刺激濃度,按CSE對(duì)細(xì)胞刺激的不同時(shí)間進(jìn)行分組,用定量PCR及Dot blot檢測(cè)myh14在各組細(xì)胞中m RNA及蛋白表達(dá)水平,并通過(guò)免疫熒光法觀察各組細(xì)胞中myh14的分布與表達(dá)。7、Western blot檢測(cè)Collagen I及α-SMA在COPD模型組及對(duì)照組肺組織中的蛋白表達(dá)水平。8、COPD模型組進(jìn)行myh14與E-cadherin、α-SMA、Collagen I之間相關(guān)性分析。結(jié)果:1、一般情況:觀察兩組小鼠毛發(fā),活動(dòng)等情況,COPD模型組小鼠較對(duì)照組出現(xiàn)活動(dòng)減少,消瘦,呼吸困難等表現(xiàn),對(duì)照組小鼠存活率100%;模型組存活率為80%。2、肺組織病理學(xué)及形態(tài)結(jié)構(gòu)變化:對(duì)照組氣道及肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰,較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡間隔無(wú)明顯增厚及斷裂出現(xiàn)。模型組氣道上皮結(jié)構(gòu)紊亂,出現(xiàn)黏液高分泌,肺泡壁斷裂并融合成肺大泡,有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組MLI及DI均較對(duì)照組升高(P0.05)。3、BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù):COPD模型組BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例均較對(duì)照組升高(P0.05)。4、免疫組化及相關(guān)性分析:對(duì)照組氣道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量myh14陽(yáng)性表達(dá),而模型組myh14表達(dá)減少(P0.05);模型組E-cadherin較對(duì)照組減少(P0.05);模型組氣道平滑肌增生較對(duì)照組明顯;模型組氣道壁膠原沉積明顯,Collagen I表達(dá)較對(duì)照組增多(P0.05)。模型組氣道上皮myh14、E-cadherin平均光密度值(IOD/area)較對(duì)照組減少(P0.05),模型組Collagen I平均光密度值(IOD/area)較對(duì)照組升高(P0.05)。平均光密度值相關(guān)性分析顯示模型組myh14與E-cadherin呈正相關(guān)(r=0.967,P0.01),與Collagen I呈負(fù)相關(guān)(r=-0.925,P0.01)。5、半定量PCR篩選COPD相關(guān)候選基因結(jié)果:經(jīng)過(guò)對(duì)兩組小鼠肺組織進(jìn)行半定量PCR COPD相關(guān)候選基因篩選,發(fā)現(xiàn)Slc9a2、Foxj1及Gif在兩組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),Chrm1、Sprr2b、Rag1、Dusp5、Cldn2、Cldn22、Scin差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),Morc3、Rela、Akt1、Pik3r1、IL6ra、Myh14、Tpm3、Crabp2、Sprr2a2、Lyn、Srrm4、C/EBP、Gabarap、Elk1、Hk2、Tjap1、Strada兩組間有明顯差異(P0.01),選取差異明顯的myh14作為COPD相關(guān)基因進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。6、CSE細(xì)胞毒性試驗(yàn):對(duì)不同CSE濃度刺激24h的16HBE細(xì)胞進(jìn)行MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活性,在CSE濃度≤2.5%時(shí),細(xì)胞活性降低不明顯,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),當(dāng)CSE濃度大于2.5%時(shí),細(xì)胞活性出現(xiàn)明顯下降(P0.01)。故選用2.5%CSE進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。7、實(shí)時(shí)熒光定量PCR:myh14在小鼠COPD模型組中相對(duì)m RNA含量(RQ值)較對(duì)照組下降(P0.05),CSE對(duì)16HBE細(xì)胞不同時(shí)間刺激(8h、24h)組中myh14m RNA水平均較對(duì)照組下降(P0.01),CSE 8h及24h刺激組間存在差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8、Dot blot、Western blot結(jié)果及相關(guān)性分析:Dot blot結(jié)果顯示,COPD模型組myh14蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組下降(P0.05),Western blot結(jié)果顯示模型組中α-SMA及collagen I蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組升高(P0.05);相關(guān)性分析顯示模型組中蛋白表達(dá)水平上myh14與α-SMA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.833,P0.05),與collagen呈負(fù)相關(guān)(r=-0.953,P0.01)。16HBE細(xì)胞經(jīng)CSE刺激(8h、24h)后,Dot blot顯示myh14在蛋白表達(dá)水平上均較對(duì)照組明顯下降(P0.01),CSE 8h及24h刺激組間存在差異性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。9、16HBE細(xì)胞中myh14免疫熒光檢測(cè):綠色熒光為myh14在細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá),myh14表達(dá)于細(xì)胞胞漿內(nèi),CSE刺激組(8h,24h)較對(duì)照組熒光表達(dá)明顯減弱(P0.01),不同CSE刺激組間存在差異,且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、CSE聯(lián)合LPS滴鼻可成功構(gòu)建小鼠COPD模型。2、COPD中存在EMT現(xiàn)象的發(fā)生。3、myh14可在人支氣管上皮細(xì)胞及小鼠支氣管上皮細(xì)胞表達(dá),且在小鼠COPD模型及經(jīng)CSE刺激的16HBE細(xì)胞中存在m RNA及蛋白水平下降。4、myh14可能在COPD發(fā)生EMT中起著重要作用,上調(diào)myh14的藥物或許能抑制EMT的發(fā)生,這使得myh14可能會(huì)成為COPD等疾病藥物治療的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：COPD 動(dòng)物模型 myh14 EMT CSE
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R563.9
【目錄】：

• 中文摘要3-7
• 英文摘要7-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-36
• 結(jié)果36-60
• 討論60-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-71
• 英漢縮略詞對(duì)照表71-72
• 致謝72-73
• 上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化與慢性阻塞性肺病的研究進(jìn)展（綜述）73-85
• 參考文獻(xiàn)79-85

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本文編號(hào)：1090949