本文關(guān)鍵詞：Toll樣受體2調(diào)控吞噬和自噬及變應(yīng)性氣道炎癥的分子機(jī)制研究

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【摘要】：Toll樣受體(TLRs)是Ⅰ型跨膜蛋白家族,在體內(nèi)主要負(fù)責(zé)感知入侵的病原體。到目前為止,已經(jīng)確定發(fā)現(xiàn)的人類TLR家族有10個(gè)成員。它們調(diào)節(jié)的天然免疫反應(yīng)被認(rèn)為參與了多種感染和炎癥性疾病的發(fā)病。本論文中,我們主要針對(duì)TLR2進(jìn)行了兩個(gè)方面的研究。1.TLR2介導(dǎo)的金黃色葡萄球菌刺激巨噬細(xì)胞吞噬和自噬信號(hào)通路的分子機(jī)制研究背景有報(bào)道顯示,Toll樣受體2(TLR2)能夠參與金葡菌的識(shí)別,然而,在金葡菌感染的氣道環(huán)境中,巨噬細(xì)胞是否能夠激活吞噬和自噬反應(yīng)予以應(yīng)對(duì),TLR2在巨噬細(xì)胞活化的天然免疫過程中所發(fā)揮的作用以及潛在的機(jī)制,目前尚未闡明清楚。研究目的1.研究金葡菌感染巨噬細(xì)胞過程中,相關(guān)吞噬和自噬信號(hào)的活化情況。2.探討TLR2及下游潛在信號(hào)級(jí)聯(lián)在金葡菌刺激巨噬細(xì)胞所誘導(dǎo)的吞噬和自噬過程中的作用。研究方法1.金葡菌刺激巨噬細(xì)胞不同時(shí)間信號(hào)分子表達(dá)及自噬的檢測(cè)金葡菌刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.715min、30min、45min、60min、120min、 240min。采用Western Blot方法檢測(cè)多種信號(hào)分子和自噬蛋白的表達(dá)；通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒的方法,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬的水平。2.RNA干擾TLR2對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬金葡菌及自噬誘導(dǎo)的影響評(píng)估TLR2 siRNA作用于RAW264.7細(xì)胞的同時(shí),給予金葡菌刺激1h。吞噬試驗(yàn)觀察細(xì)胞吞噬金葡菌；通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒的方法,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞自噬的水平；同時(shí),采用Western Blot方法檢測(cè)吞噬和自噬蛋白的表達(dá)。3.靶向抑制JNK對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬金葡菌及自噬誘導(dǎo)的影響評(píng)估JNK特異性抑制劑SP600125處理RAW264.7細(xì)胞的同時(shí),給予金葡菌刺激1h。吞噬試驗(yàn)觀察細(xì)胞吞噬金葡菌；通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒的方法,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬的水平；同時(shí),采用Western Blot方法檢測(cè)吞噬和自噬蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果1.金葡菌刺激巨噬細(xì)胞活化多種信號(hào)通路及自噬RAW264.7細(xì)胞在金葡菌刺激作用下,P-JNK、P-ERK、P-p38 MAPKs, MyD88, P-Akt, GTP-Rac1的表達(dá)顯著增加,在活化的MAPKs中,僅有JNK磷酸化水平的升高是以一種時(shí)間依賴性方式進(jìn)行的；與此同時(shí),金葡菌刺激RAW264.7細(xì)胞明顯上調(diào)了自噬蛋白Beclin-1和LC3-II的表達(dá),以及細(xì)胞中GFP-LC3點(diǎn)狀顆粒的表達(dá)數(shù)量。2.TLR2對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬金葡菌以及金葡菌誘導(dǎo)的自噬至關(guān)重要在TLR2 siRNA作用下,RAW264.7細(xì)胞吞噬金葡菌的能力顯著降低,金葡菌刺激誘導(dǎo)的P-Akt、GTP-Rac1吞噬蛋白以及P-JNK的表達(dá)顯著下調(diào),但不減弱ERK、 p38的磷酸化；給予RAW264.7細(xì)胞siRNA沉默TLR2,金葡菌刺激細(xì)胞活化的自噬蛋白Beclin-1和LC3-II的表達(dá)水平明顯降低,細(xì)胞中GFP-LC3點(diǎn)狀顆粒的表達(dá)數(shù)量也相應(yīng)的減少。3.TLR2依賴的JNK信號(hào)通路參與巨噬細(xì)胞吞噬金葡菌以及金葡菌誘導(dǎo)的自噬JNK抑制劑作用RAW264.7細(xì)胞減弱了細(xì)胞吞噬金葡菌的能力,下調(diào)了金葡菌刺激誘導(dǎo)的吞噬蛋白P-Akt和GTP-Rac1的表達(dá)；給予RAW264.7細(xì)胞SP600125處理,金葡菌刺激細(xì)胞活化的自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)水平降低,細(xì)胞中GFP-LC3點(diǎn)狀顆粒的表達(dá)數(shù)量也相應(yīng)的減少。TLR2 siRNA和SP600125同時(shí)作用與TLR2 siRNA單獨(dú)作用相比,并未進(jìn)一步降低RAW264.7細(xì)胞吞噬金葡菌的能力以及金葡菌刺激細(xì)胞活化的自噬水平。研究結(jié)論1.金葡菌刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)了吞噬和自噬活化。2.TLR2通過JNK信號(hào)通路介導(dǎo)了金葡菌刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的吞噬和自噬,是一種新的可能的天然免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。2.靶向抑制TLR2基因敲除小鼠JNK信號(hào)對(duì)變應(yīng)性氣道炎癥及自噬活化的影響研究背景據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)評(píng)估,全世界超過3億人罹患支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)。目前,已有的TLR2激活的天然免疫反應(yīng)在哮喘發(fā)病中的作用研究仍存在爭(zhēng)議。另外,哮喘發(fā)病過程中自噬的發(fā)生情況也不十分清楚。考慮到是哮喘最具特征性的臨床表現(xiàn)之一,TLR2在變應(yīng)性氣道炎癥中的作用,和對(duì)相關(guān)自噬活化的影響及潛在的信號(hào)機(jī)制有待闡明。研究目的1.觀察變應(yīng)性氣道炎癥模型中TLR2的表達(dá)情況。2.探討TLR2及下游潛在信號(hào)級(jí)聯(lián)在小鼠變應(yīng)性氣道炎癥及自噬活化中的作用。研究方法1.建立變應(yīng)性氣道炎癥模型,檢測(cè)野生型小鼠肺組織中TLR2的表達(dá)卵清蛋白(OVA)致敏和激發(fā)野生型小鼠。采用Western Blot方法檢測(cè)野生型小鼠肺組織中TLR2的蛋白表達(dá)水平；通過免疫熒光的方法,熒光倒置顯微鏡觀察野生型小鼠氣道TLR2的表達(dá)。2.TLR2基因敲除對(duì)小鼠變應(yīng)性氣道炎癥及自噬活化的影響評(píng)估OVA致敏和激發(fā)TLR2-/-小鼠。組織病理學(xué)分析小鼠氣道表現(xiàn),HE染色觀察小鼠氣道炎癥表現(xiàn),PAS染色觀察小鼠氣道杯狀細(xì)胞增生及粘液分泌；瑞氏染色計(jì)數(shù)BALF中炎性細(xì)胞數(shù)目；ELISA檢測(cè)小鼠血清中OVA sIgE, BALF中TNF-α、IL-10的水平。采用Western Blot方法檢測(cè)小鼠肺組織中炎癥信號(hào)分子和自噬蛋白的表達(dá)。3.靶向抑制JNK對(duì)小鼠變應(yīng)性氣道炎癥及自噬活化的影響評(píng)估OVA致敏和激發(fā)小鼠的同時(shí),給予JNK特異性抑制劑SP600125處理。組織病理學(xué)分析小鼠氣道表現(xiàn),HE染色觀察小鼠氣道炎癥表現(xiàn),PAS染色觀察小鼠氣道杯狀細(xì)胞增生及粘液分泌；瑞氏染色計(jì)數(shù)BALF中炎性細(xì)胞數(shù)目；ELISA檢測(cè)小鼠血清中OVA sIgE, BALF中TNF-α、IL-10的水平。采用Western Blot方法檢測(cè)小鼠肺組織中炎癥信號(hào)分子和自噬蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果1.OVA誘導(dǎo)野生型小鼠肺組織中TLR2表達(dá)上調(diào)同對(duì)照組相比,OVA激發(fā)的野生型小鼠肺組織中TLR2表達(dá)水平顯著增加,并且主要定位于支氣管周圍和肺泡壁。2.TLR2基因敲除明顯緩解OVA誘發(fā)的小鼠氣道炎癥OVA激發(fā)條件下,TLR2-/-小鼠同野生型小鼠相比,血清中OVA sIgE水平顯著降低,支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn),管壁增厚,上皮杯狀細(xì)胞增生,粘液分泌等氣道炎癥表現(xiàn)均有明顯減弱；BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,TNF-α表達(dá)明顯下調(diào)。3.TLR2基因敲除明顯降低OVA誘導(dǎo)的小鼠肺組織炎癥和自噬信號(hào)的活化水平OVA激發(fā)條件下,野生型小鼠肺組織中MyD88、Akt、NF-κB和MAPK (JNK、 ERK、p38)炎癥信號(hào)以及自噬的活化水平增高。TLR2-/-小鼠同野生型小鼠相比,OVA誘導(dǎo)的肺組織P-JNK、P-Akt和P-p65炎癥蛋白以及Beclin-1和LC3-Ⅱ自噬蛋白的表達(dá)水平顯著減弱。4.抑制JNK減輕OVA誘發(fā)的小鼠氣道炎癥OVA激發(fā)條件下,SP600125處理的野生型小鼠同未干預(yù)野生型小鼠相比,血清中OVA sIgE水平降低,支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn),管壁增厚,上皮杯狀細(xì)胞增生,粘液分泌等氣道炎癥表現(xiàn)均有減弱；BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量減少,TNF-α表達(dá)下調(diào)。SP600125處理的TLR2-/-小鼠同未干預(yù)TLR2-/-小鼠相比,OVA誘發(fā)的氣道炎癥表現(xiàn)并未進(jìn)一步減弱。5.抑制JNK下調(diào)OVA誘導(dǎo)的小鼠肺組織炎癥和自噬信號(hào)的活化水平SP600125處理的野生型小鼠同未干預(yù)野生型小鼠相比,OVA誘導(dǎo)的肺組織JNK、 Akt和NF-κB炎癥信號(hào)的活化以及Beclin-1和LC3-Ⅱ自噬蛋白的表達(dá)水平減弱。SP600125處理的TLR2-/-小鼠同未干預(yù)TLR2-/-小鼠相比,OVA誘導(dǎo)的氣道炎癥及自噬信號(hào)的活化并未進(jìn)一步下調(diào)。研究結(jié)論1.變應(yīng)性氣道炎癥模型TLR2表達(dá)上調(diào)。2.TLR2通過JNK信號(hào)利于變應(yīng)性氣道炎癥的發(fā)生,同時(shí)伴隨自噬的活化,尋找到了一種新的可能的防治變應(yīng)性氣道炎癥的信號(hào)靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細(xì)胞 金黃色葡萄球菌 Toll樣受體2 吞噬 自噬 c-Jun氨基末端激酶變應(yīng)性氣道炎癥 天然免疫
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R56
【目錄】：

• 中英文對(duì)照詞表5-7
• 摘要7-12
• Abstract12-19
• 第一部分 TLR2介導(dǎo)的金黃色葡萄球菌刺激巨噬細(xì)胞吞噬和自噬信號(hào)通路的分子機(jī)制19-58
• 1. 引言19-20
• 2. 材料與方法20-34
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-50
• 4. 討論50-53
• 5. 參考文獻(xiàn)53-58
• 第二部分 靶向抑制TLR2基因敲除小鼠JNK信號(hào)對(duì)變應(yīng)性氣道炎癥及自噬活化的影響58-101
• 1. 引言58-59
• 2. 材料與方法59-76
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果76-91
• 4. 討論91-94
• 5. 參考文獻(xiàn)94-101
• 下一步工作設(shè)想101-102
• 附錄102-105
• 致謝105-107
• 綜述 天然免疫識(shí)別受體TLRs在肺部炎癥中的研究進(jìn)展107-129
• 參考文獻(xiàn)118-129

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;The role of Toll-like receptors in non-infectious lung injury[J];Cell Research;2006年08期

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本文編號(hào)：1042612