本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3調(diào)控循環(huán)纖維細(xì)胞在放射性肺纖維化中的作用研究

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【摘要】：目的意義:放射性肺纖維化是臨床胸部腫瘤放療常見的并發(fā)癥之一,也可發(fā)生于骨髓移植手術(shù)前的放療預(yù)處理及其它意外照射,其主要特征為肺臟內(nèi)纖維結(jié)締組織增多,實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少,持續(xù)進(jìn)展可致肺臟結(jié)構(gòu)破壞和功能減退,乃至肺功能衰竭,嚴(yán)重威脅人類健康和生命。臨床上放射性肺纖維化缺乏特異、有效的治療措施,患者預(yù)后較差。因此研究并闡明放射性肺纖維化發(fā)生的規(guī)律與特征和分子機(jī)制,對(duì)于臨床上預(yù)測(cè)放射性肺纖維化的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸,尋找干預(yù)、治療的手段有著極其重要的意義。研究表明,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1(transforming growth factor-β,TGF-β1)是重要的促纖維化因子之一,在肺纖維化過(guò)程中調(diào)控成纖維細(xì)胞分裂、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,促進(jìn)纖維化的發(fā)生。然而TGF-β3在組織損傷修復(fù)中表現(xiàn)出了不同于TGF-β1的抗纖維化特性,但是目前缺少TGF-β3用于放射性肺纖維化干預(yù)措施的依據(jù)。本研究以雌性C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,建立放射性肺纖維化模型,觀察TGF-β3對(duì)小鼠放射性肺纖維化的影響,尋找TGF-β3在放射性肺纖維化中可能的調(diào)控機(jī)制,為臨床放射性肺纖維化的預(yù)防和治療提供新的線索。材料與方法:雌性C57BL/6小鼠(6-8周,20±2g)麻醉后固定于自制的照射板上,除胸部外其余部分用10cm鉛磚防護(hù),采用60Coγ-射線單次胸部照射,照射劑量為20Gy,照射源距3m,劑量率215c Gy/min。在照后4h照射組給予腹腔注射0.5ml生理鹽水,TGF-β3組給予0.5ml人重組TGF-β3(1μg/kgbw,生理鹽水稀釋),此后每周給藥一次。分別于照后1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月,觀察小鼠的大體情況,檢測(cè)外周血細(xì)胞參數(shù),活殺后進(jìn)行常規(guī)病理檢查和Masson三色染色觀察,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9,MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1)的表達(dá),檢測(cè)肺灌洗液(BALF)中細(xì)胞分類及細(xì)胞因子含量,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外周血Treg、肺內(nèi)循環(huán)纖維細(xì)胞、Th17與Treg等。采用分離培養(yǎng)人外周血白膜的單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)及Treg細(xì)胞建立體外培養(yǎng)體系,分別以不同劑量、不同比例的TGF-β1和TGF-β3混合刺激PBMC,通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)PBMC向循環(huán)纖維細(xì)胞的分化情況。并將Treg細(xì)胞與PBMC共培養(yǎng),檢測(cè)Treg細(xì)胞對(duì)PBMC向循環(huán)纖維細(xì)胞的分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、60~Coγ-射線單次胸部20Gy照射后小鼠體重增加變緩,肺重略微增加,因而肺臟系數(shù)也略微增加。2、小鼠照射后外周血白細(xì)胞數(shù)有一定波動(dòng),TGF-β3組血紅細(xì)胞顯著降低(P0.05),血小板有增高趨勢(shì)。3、BALF中有核細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類結(jié)果顯示照射組與TGF-β3組BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)有增高的趨勢(shì),但統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著差異。液體懸浮芯片細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示照射后小鼠BALF中趨化因子有先增高后降低的趨勢(shì)。而TGF-β3組促炎因子IL-12分泌增多、抑炎因子IL-4分泌減少。照射組的促炎因子IL-17隨著照后時(shí)間延長(zhǎng)有增加的趨勢(shì),其中在照后6個(gè)月顯著高于對(duì)照組(P0.05),而TGF-β3組的IL-17變化情況跟照射組正好相反,在照后1個(gè)月時(shí)顯著增加(P0.05),隨后降低并恢復(fù)至正常水平。生長(zhǎng)因子中,照射組和TGF-β3組的FGF-basic在照后出現(xiàn)了先增高再降低最后恢復(fù)的波動(dòng)情況。照射組的VEGF在照后有增高的趨勢(shì),其中在照后1個(gè)月和照后6個(gè)月時(shí)與對(duì)照組相比顯著增加(P0.05)。4、照射能夠引起照射組小鼠出現(xiàn)肺泡壁增厚、肺泡間隔明顯增寬、成纖維細(xì)胞大量增生、肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞、膠原纖維大量沉積的典型纖維化病理改變。給予TGF-β3組小鼠病理變化比照射組出現(xiàn)的晚且程度較輕,同時(shí)膠原沉積減少,但仍然可見炎性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),蛋白樣液體滲出,局部肺泡萎陷,部分肺泡腔融合擴(kuò)大,局部肺泡間隔增寬,以及部分綠染的膠原纖維。5、免疫組化結(jié)果顯示照射后小鼠肺內(nèi)MMP-9、TIMP-1表達(dá)與對(duì)照組相比均明顯增加,其中MMP-9隨照后時(shí)間的延長(zhǎng)增加的更為顯著,TGF-β3組MMP-9表達(dá)顯著高于照射組(P0.05)。TIMP-1隨照后時(shí)間延長(zhǎng)變化趨勢(shì)不明顯。6、照射組小鼠從照后1個(gè)月起肺內(nèi)循環(huán)纖維細(xì)胞明顯增加(P0.05),隨照后時(shí)間的延長(zhǎng),出現(xiàn)降低,但仍高于對(duì)照組(P0.05)。照后1個(gè)月時(shí),TGF-β3組循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)明顯低于照射組(P0.05),與對(duì)照組相比仍有增高(P0.05);3m時(shí)與照射組水平接近;而6個(gè)月時(shí)低于照射組,恢復(fù)至對(duì)照組水平。7、照射組和TGF-β3組外周血Treg細(xì)胞比例隨著照后時(shí)間的延長(zhǎng)有降低趨勢(shì),但與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。照射組肺內(nèi)Th17細(xì)胞比例均顯著高于對(duì)照組(P0.05),而且隨著照后時(shí)間延長(zhǎng)而增高。而TGF-β3組變化規(guī)律和照射組相反,Th17細(xì)胞比例隨著照后時(shí)間延長(zhǎng)而降低,在照后1個(gè)月達(dá)到高峰,且顯著高于照射組(P0.05),到了照后6個(gè)月時(shí),雖然仍然顯著高于對(duì)照組(P0.05),但已經(jīng)顯著低于照射組(P0.05)。照射組肺內(nèi)Treg細(xì)胞比例均顯著高于對(duì)照組(P0.05),而且隨著照后時(shí)間延長(zhǎng)而降低。而TGF-β3組Treg細(xì)胞比例隨著照后時(shí)間延長(zhǎng)而波動(dòng),其中在照后3個(gè)月達(dá)到高峰,且顯著高于照射組(P0.05)。照射組Th17/Treg細(xì)胞比例隨著照后時(shí)間延長(zhǎng)而增高,其中在照后6個(gè)月時(shí)顯著高于對(duì)照組(P0.05)。而TGF-β3組Th17/Treg細(xì)胞比例隨著照后時(shí)間延長(zhǎng)而降低,在照后1個(gè)月達(dá)到高峰,顯著高于照射組與對(duì)照組(P0.05),到了照后6個(gè)月時(shí),與對(duì)照組相比已經(jīng)無(wú)明顯差異并且顯著低于照射組(P0.05)。8、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TGF-β1和TGF-β3都能促進(jìn)體外培養(yǎng)的人PBMC向循環(huán)纖維細(xì)胞分化,但TGF-β3的促分化能力顯著弱于TGF-β1。另外TGF-β3能夠部分拮抗TGF-β1誘導(dǎo)PBMC向循環(huán)纖維細(xì)胞分化的能力。Treg在一定比例時(shí)與PBMC共培養(yǎng)可以促進(jìn)PBMC向循環(huán)纖維細(xì)胞分化,但隨著Treg與PBMC的比例上升,Treg反而表現(xiàn)出抑制PBMC向循環(huán)纖維細(xì)胞分化的能力,而且這種調(diào)控能力并不依賴于Treg和PBMC的接觸抑制。結(jié)論：1、TGF-β3可以減輕小鼠放射性肺纖維化的程度,延緩放射性肺纖維化的病程。2、TGF-β3通過(guò)調(diào)節(jié)肺內(nèi)MMP-9/TIMP-1比例、Th1/Th2型細(xì)胞因子、Th17/Treg細(xì)胞平衡、減少肺內(nèi)循環(huán)纖維細(xì)胞的募集與分化減輕小鼠放射性肺纖維化。3、TGF-β3可以部分拮抗TGF-β1誘導(dǎo)的體外離體培養(yǎng)的循環(huán)纖維細(xì)胞的分化。4、Treg可以調(diào)控體外離體培養(yǎng)的循環(huán)纖維細(xì)胞的分化。TGF-β3可能通過(guò)調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞比例調(diào)控調(diào)控體外離體培養(yǎng)的循環(huán)纖維細(xì)胞的分化。
【關(guān)鍵詞】：放射性肺纖維化 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 循環(huán)纖維細(xì)胞 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 輔助性T細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.55
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 縮略詞表續(xù)5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-17
• 第一部分TGF-β3對(duì)小鼠放射性肺纖維化的影響17-44
• 1.1 引言17
• 1.2 材料與方法17-23
• 1.3 結(jié)果23-41
• 1.4 討論41-44
• 第二部分TGF-β3在小鼠放射性肺纖維化中的調(diào)控機(jī)制研究44-55
• 2.1 引言44
• 2.2 材料與方法44-48
• 2.3 結(jié)果48-52
• 2.4 討論52-55
• 第三部分TGF-β3與Treg對(duì)離體培養(yǎng)的人循環(huán)纖維細(xì)胞分化的影響55-68
• 3.1 引言55-56
• 3.2 材料與方法56-60
• 3.3 結(jié)果60-66
• 3.4 討論66-68
• 全文總結(jié)及創(chuàng)新點(diǎn)68-70
• 參考文獻(xiàn)70-81
• 綜述81-96
• 參考文獻(xiàn)89-96
• 論著96-103
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷103-104
• 致謝10

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1 楊s，

本文編號(hào)：804758