背景 近年來,隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展,一種從分子水平治療缺血性心臟病的新方法即“分子搭橋術(shù)”逐漸受到了人們的重視。所謂“分子搭橋術(shù)”是指用促血管生長因子誘導(dǎo)心肌新生血管形成,刺激心肌缺血部位的自我搭橋,從而提高心肌側(cè)支循環(huán)的代償能力,實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性心肌再血管化,以消除或減輕心肌缺血,也稱為“治療性血管新生”。目前研究最多的治療性血管新生方法為通過載體把目的基因?qū)胄难芙M織。但由于傳統(tǒng)的病毒載體或非病毒載體的安全性差和轉(zhuǎn)染效率低等的多種不足,嚴(yán)重的影響了基因治療的臨床療效,因此建立和發(fā)展高效、安全、可控、實(shí)用的基因載體系統(tǒng)已成為基因治療研究的重點(diǎn)。近年來研究表明,不僅超聲照射本身有促進(jìn)基因體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染的作用,而且超聲介導(dǎo)微泡造影劑破裂可明顯增加基因的轉(zhuǎn)染效率,是一種安全的基因運(yùn)載系統(tǒng)。 目前臨床所用超聲造影劑均為內(nèi)含氣體的微氣泡。其外殼的成膜材料多樣,包括磷脂類化合物、白蛋白、糖類、非離子表面活性劑或可生物降解的高分子多聚物等,其內(nèi)通常充入氣體,包括二氧化碳、氧氣、空氣或大分子惰性氣體(多為氟烷氣體)等。由于造影劑的蛋白質(zhì)或陽離子脂質(zhì)體外殼通常帶正電荷,而質(zhì)粒通常帶有大量負(fù)電荷,因此可以使目的基因粘附于微泡表面；此外,脂質(zhì)外殼的微泡還可以在其表面裝配不同的配體,如抗體、氨基酸、多糖等物質(zhì),這為制備具有組織特異性的靶向微泡創(chuàng)造了可能性。臨床上常用的SonoVue微泡為含六氟化硫氣體的微泡造影劑,外殼含有脂質(zhì)成分。形成的微泡平均直徑為2.5μm。 大量資料顯示,超聲不僅可以使細(xì)胞膜通透性增加,而且微泡破裂后還可使微血管破裂,內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬。Bao等[2]的研究認(rèn)為：產(chǎn)生這些效應(yīng)的主要的機(jī)制是超聲的“空化效應(yīng)”(cavication),所謂空化效應(yīng)是指微氣泡在聲波作用下表現(xiàn)出“震蕩”或“爆聚”活性,而隨之形成的微流、射流和沖擊波等激烈過程會(huì)使其周圍的組織細(xì)胞壁被擊穿,產(chǎn)生可逆或不可逆的小孔。由于微泡的存在又可以降低超聲空化的域值。因此,通過對(duì)攜帶目的基因的微泡進(jìn)行靶部位的超聲照射,由空化效應(yīng)導(dǎo)致的微泡破裂可以使微泡定向釋放所攜帶的基因,同時(shí)空化效應(yīng)產(chǎn)生的休克波會(huì)使局部毛細(xì)血管和鄰近組織細(xì)胞膜的通透性增高,從而使目的基因更容易進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi),實(shí)現(xiàn)并增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。 利用微泡攜帶目的基因的方法主要有4種[3]：①將基因粘附于微泡外殼表面或包埋于外殼內(nèi)；②把基因整合入微泡內(nèi)部；③通過靜電作用,將基因共價(jià)結(jié)合到微泡表面；④在微泡外殼中加入一層油酯物質(zhì)包繞微泡,然后將疏水性藥物整合入這層油酯中。目前多采用前兩種方法來實(shí)現(xiàn)目的基因與微泡的連接。其一,將微泡與裸基因或基因載體混合后經(jīng)外周血管同時(shí)注入體內(nèi),待其到達(dá)靶組織后用超聲照射靶區(qū)。通過超聲輻照引起的微泡破裂和局部微血管及細(xì)胞通透性的增加,促使血管內(nèi)的基因進(jìn)入周圍組織。Shohet等[4]將腺病毒p半乳糖苷酶基因與微泡混合,再去除過量基因,獲得粘附有基因的微泡,并將這種載基因微泡經(jīng)靜脈注入小鼠體內(nèi),進(jìn)行超聲輻照,4天后可檢測到小鼠心肌組織中p半乳糖苷酶活性比對(duì)照組增加10倍；而若先后輸入微泡和p半乳糖苷酶基因,則心肌組織中p半乳糖苷酶的活性僅比對(duì)照組增加2倍,說明基因與微泡粘附更能提高基因的轉(zhuǎn)染率。其二,是將基因包裹在微氣泡的內(nèi)部,將微氣泡制備為基因載體,當(dāng)其經(jīng)過外周血管注入到達(dá)靶組織時(shí),進(jìn)行超聲輻照破裂微泡,使其內(nèi)部的基因物質(zhì)在局部釋放出來。Frenkel等[5]通過超聲振蕩法將熒光素酶質(zhì)粒整合入白蛋白微泡外殼中,并用超聲輻照進(jìn)行細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染,結(jié)果顯示,當(dāng)DNA濃度為4000μg/ml時(shí),微泡包載DNA組對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率最高。 靶向超聲微泡的應(yīng)用是進(jìn)行超聲分子顯像的基礎(chǔ),而制備靶向微泡的關(guān)鍵技術(shù)在于微泡的表面修飾,即如何將特異性好、活性高的配體牢固結(jié)合到微泡表面。目前連接方法常用的有共價(jià)法或非共價(jià)法。其中非共價(jià)結(jié)合多通過生物素-親和素連接技術(shù)；而共價(jià)結(jié)合多采用羧酸酯類衍生物介導(dǎo)配體與微泡外殼連接。 ICAM-1是細(xì)胞粘附分子免疫球蛋白家族的一個(gè)成員,主要表達(dá)于活化內(nèi)皮細(xì)胞和其他抗原遞質(zhì)細(xì)胞上,介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的粘附反應(yīng)。炎癥細(xì)胞因子等誘發(fā)的ICAM-1表達(dá)上調(diào)及由后者介導(dǎo)的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用,是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素。缺血后多種炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1,使其水平增高,而且內(nèi)皮細(xì)胞受損后暴露了一些炎性細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn),如ICAM-1位點(diǎn),微泡對(duì)這些暴露的炎性細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)可能具有某種親和力。由于ICAM-1在正常組織中幾乎不表達(dá),所以抗ICAM-1抗體標(biāo)記的靶向微泡可特異結(jié)合于受損內(nèi)皮表面。Villanueva和Weller等[8,9]均發(fā)現(xiàn)損傷的冠脈內(nèi)皮表面可粘附大量攜抗ICAM-1抗體的微泡,并可據(jù)此來評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞功能和急性心臟排斥反應(yīng)。研究表明連接了特異性配體的微泡能夠更好的在靶組織聚集,因此,若將靶向微泡作為目的基因的載體,則與微泡連接的特異性配體則能增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的靶向性,減少基因治療的副作用,進(jìn)一步增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)染效率。 ANG-1基因是血管生成素家族的一種,主要由血管周圍細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌表達(dá)。ANG-1在血管新生中發(fā)揮多種作用,可促進(jìn)血管成熟,減少血管滲漏,維持血管的穩(wěn)定性。Thurs-ton等[10]分別在ANG-1和VEGF的轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚血管內(nèi)注入Evan藍(lán)染料,對(duì)由芥子油誘發(fā)的血管炎癥反應(yīng),ANG-1轉(zhuǎn)基因小鼠的血管滲漏情況較VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠輕,炎癥反應(yīng)不明顯；另外,ANG-1還能與內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性受體Tie-2氨酸激酶結(jié)合使細(xì)胞內(nèi)Tie-2氨酸磷酸化形成二聚體,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有強(qiáng)有力的特異性趨化及遷移作用。因此,ANG-1與VEGF作用于血管新生的不同環(huán)節(jié),而且在很多方面ANG-1可以彌補(bǔ)VEGF的不足。 實(shí)驗(yàn)一pEGFP-C3-hANG-1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 目的構(gòu)建含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C3-h ANG-1,并探尋滿足基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)所需大量質(zhì)粒的提取方法。 方法從pAAV ANG-1質(zhì)粒中利用PCR技術(shù)獲得兩端添加HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的hANG-1基因片段。將酶切鑒定正確的pEGFP-C3載體經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后,利用定向克隆技術(shù)將hANG-1基因片段和pEGFP-C3載體進(jìn)行連接,獲得重組的pEGFP-C3-hANG-1,并電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增,篩選陽性克隆,經(jīng)過酶切電泳鑒定和DNA測序證明所構(gòu)建質(zhì)粒的正確性。最后利用氯化銫密度梯度離心法大量提取重組pEGFP-C3-hANG-1質(zhì)粒。 結(jié)果pEGFP-C3-hANG-1質(zhì)粒的單酶切和雙酶切鑒定均可得到與預(yù)期條帶大小相同的目的條帶,hAng-1序列測定分析亦證明真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C3-hANG-1構(gòu)建成功,開放閱讀框架正確。氯化銫密度梯度離心法可一次提取大量高純度質(zhì)粒,保證基因轉(zhuǎn)染時(shí)質(zhì)粒性質(zhì)的一致性。 結(jié)論利用基因克隆重組技術(shù)能成功將hANG-1基因克隆入pEGFP-C3載體中,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C3-hANG-1。 實(shí)驗(yàn)二超聲聯(lián)合SonoVue微泡輻照促進(jìn)pEGFP-C3-hANG-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染的條件優(yōu)化和基因表達(dá)完整性的研究 目的探討超聲聯(lián)合SonoVue微泡介導(dǎo)人血管生成素(hANG-1)基因體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)多種影響因素對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞生存率的影響,并確定最佳轉(zhuǎn)染條件；同時(shí)觀察超聲聯(lián)合微泡輻照對(duì)基因完整性和表達(dá)的影響。 方法構(gòu)建pEGFP-C3-hANG-1質(zhì)粒,根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)組的設(shè)計(jì),應(yīng)用相應(yīng)的微泡聯(lián)合超聲輻照條件進(jìn)行人胚腎293T細(xì)胞的pEGFP-C3-hANG-1基因轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48h,以熒光顯微鏡觀察到綠色熒光為轉(zhuǎn)染成功標(biāo)志；流式細(xì)胞術(shù)檢測基因轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞率,臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞生存率；瓊脂糖凝膠電泳檢測經(jīng)超聲輻照后質(zhì)粒的完整性；RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測hANG-1基因的mRNA和蛋白表達(dá)。 結(jié)果①超聲聲強(qiáng)1.5 w／cm2,輻照時(shí)間30s,微泡濃度20%,DNA濃度15μg/ml時(shí)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染可獲較好轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞生存率；②轉(zhuǎn)染體系中血清的存在并不影響轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞生存率；③細(xì)胞懸浮狀態(tài)下轉(zhuǎn)染可顯著提高基因轉(zhuǎn)染效率,降低細(xì)胞死亡率；④最適轉(zhuǎn)染條件下的超聲輻照劑量不會(huì)影響質(zhì)粒的完整性,且轉(zhuǎn)染后的基因可正常表達(dá)mRNA并翻譯目的基因的蛋白。 結(jié)論超聲聯(lián)合微泡輻照能夠提高體外細(xì)胞目的基因的轉(zhuǎn)染效率,血清的存在并不影響基因的轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后的基因能順利地表達(dá)并具有正常功能。 實(shí)驗(yàn)三攜ICAM-1抗體的SonoVue微泡靶向識(shí)別受損內(nèi)皮 目的探討靜電吸附法制備的攜ICAM-1抗體靶向微泡在體外和體內(nèi)的尋靶能力。 方法采用靜電吸附法制備攜ICAM-1抗體的靶向SonoVue微泡。體外培養(yǎng)經(jīng)IL-1β刺激大量表達(dá)ICAM-1的人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304,采用免疫熒光法檢測靶向微泡與其結(jié)合能力。構(gòu)建兔急性心肌梗塞模型,靜脈注射攜ICAM-1抗體的靶向SonoVue微泡進(jìn)行心肌造影,采用冷凍切片和免疫熒光法檢測靶向微泡與受損血管內(nèi)膜結(jié)合能力。 結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)中,可見大量攜ICAM-1抗體靶向微泡與刺激后ECV304細(xì)胞緊密結(jié)合,僅有少量靶向微泡與正常ECV304細(xì)胞結(jié)合。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,可見大量攜ICAM-1抗體靶向微泡在兔梗塞心肌受損血管內(nèi)膜處粘附,僅可見少量靶向微泡在正常血管內(nèi)膜處粘附。 結(jié)論攜ICAM-1抗體靶向微泡在體內(nèi)、體外均能與受損血管內(nèi)皮特異性結(jié)合,不僅有利于靶向超聲造影顯像,更為微泡攜帶藥物或基因在局部定向釋放開辟良好前景。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R445.1
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
引言
正文
    第一部分
        前言
        材料和方法
        結(jié)果
        討論
        結(jié)論
        參考文獻(xiàn)
    第二部分
        前言
        材料和方法
        結(jié)果
        討論
        結(jié)論
        參考文獻(xiàn)
    第三部分
        前言
        材料與方法
        結(jié)果
        討論
        結(jié)論
        參考文獻(xiàn)
綜述
    綜述一
    綜述二
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后記

【參考文獻(xiàn)】

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