【摘要】：目的：(1)研究ZNF545基因在肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)中的表觀遺傳學(xué)改變及對(duì)其表達(dá)的調(diào)控探討ZNF545在HCC發(fā)生中的作用及作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上,闡明ZNF545表觀遺傳改變對(duì)早期HCC超聲引導(dǎo)下熱消融治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值及其對(duì)HCC生存預(yù)后的影響,以期獲得HCC診斷和預(yù)后的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物。(2)采用隨機(jī)對(duì)照研究(Randomized controlled trial, RCT)觀察經(jīng)皮水冷微波消融(Microwave ablation, MWA)與經(jīng)皮水冷雙極射頻消融(Radiofrequency ablation, RFA)治療早期肝細(xì)胞癌的中期療效,為肝癌的臨床微創(chuàng)熱消融治療方式選擇提供進(jìn)一步的理論及臨床依據(jù)。(3)采用前瞻性隊(duì)列對(duì)照研究,觀察比較經(jīng)皮水冷MWA及RFA與手術(shù)切除治療早期肝細(xì)胞癌的中期療效,為肝癌的治療手段的選擇提供理論依據(jù)。 材料和方法：1、表觀遺傳研究：應(yīng)用半定量RT-PCR方法在7株肝癌細(xì)胞系及一株永生化肝細(xì)胞系(HepG2、SMMC7721、SUN449、HBXF34、PLC-PRF-5、SK-Hep1、 BEL7402及LO2)中檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制齊5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dc)處理前后ZNF545在mRNA的表達(dá)水平；應(yīng)用甲基化特異性PCR檢測(cè)7株肝癌細(xì)胞系、一株永生化肝細(xì)胞系、8例正常肝組織、10例肝硬化組織和101例HCC組織標(biāo)本中ZNF545的甲基化情況；應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)20例具有石蠟包塊的肝癌組織和配對(duì)癌旁組織中ZNF545的表達(dá)水平；克隆形成實(shí)驗(yàn)分析ZNF545對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)ZNF545對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；利用MTT檢測(cè)ZNF545對(duì)細(xì)胞增殖的影響；聯(lián)合患者年齡、性別、肝功Child分級(jí)、甲胎蛋白、腫瘤數(shù)目、大小、病理分級(jí)、病毒含量、肝炎類(lèi)型、消融后局部復(fù)發(fā)、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、生存等進(jìn)行多因素分析ZNF545的甲基化情況與早期HCC熱消融治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的相關(guān)性及其對(duì)HCC生存預(yù)后的影響。2、臨床對(duì)照研究：(1)2008年10月至2013年1月滿(mǎn)足以下入組標(biāo)準(zhǔn)在我院行超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮消融治療的290例HCC患者共364個(gè)病灶,按照計(jì)算機(jī)產(chǎn)生序號(hào)隨機(jī)分為兩組,其中MWA組146例192個(gè)病灶,RFA組144例172個(gè)病灶,入組患者滿(mǎn)足以下標(biāo)準(zhǔn)：a)術(shù)前評(píng)估肝臟功能：Child-Pugh A或B級(jí),凝血酶原時(shí)間25秒,凝血酶原活動(dòng)度40%；b)單個(gè)結(jié)節(jié)直徑≤5cm,結(jié)節(jié)數(shù)目≤3個(gè)；c)術(shù)前影像學(xué)檢查及術(shù)中探查判斷無(wú)明確的靜脈、膽管癌栓和肝外轉(zhuǎn)移；d)病理證實(shí)為HCC；e)術(shù)前無(wú)抗癌處理；f)自愿受試,術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。(2)滿(mǎn)足以上入組標(biāo)準(zhǔn)2008年8月至2013年1月在我院行超聲引導(dǎo)下消融治療的290例HCC患者共364個(gè)病灶設(shè)為消融組,同期進(jìn)行手術(shù)切除306例患者339個(gè)病灶設(shè)為手術(shù)組。分別觀察比較兩組治療時(shí)間、術(shù)后住院日、住院費(fèi)用、技術(shù)有效率(Technique effectiveness rate, TER)、局部腫瘤進(jìn)展率(Local tumor progression, LTP)、肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移率、并發(fā)癥發(fā)生率和中期生存率。 結(jié)果：1、表觀遺傳研究：MSP檢測(cè)ZHF545基因在細(xì)胞系結(jié)果顯示,HepG2、 SMMC7721、SUN449、PRF-PLC-5、 Sk-hep1及L02完全甲基化狀態(tài),Be17402呈部分甲基化狀態(tài)及HBXF344呈未甲基化狀態(tài)；經(jīng)RT-PCR方法檢測(cè)ZNF545基因mRNA水平上在肝細(xì)胞系Be17402及HBXF344中,經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制5-aza-dc處理前后無(wú)變化,其余肝癌細(xì)胞系經(jīng)5-aza-dc處理后均恢復(fù)表達(dá)�；謴�(fù)HepG2、SUN449中ZNF545的表達(dá)可抑制克隆形成和細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在101例HCC組織中,ZNF545甲基化率為56.4%(57/101),在正常肝組織和肝硬化組織中均無(wú)甲基化改變提示ZNF545是一個(gè)潛在的HCC診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。單因素分析結(jié)果顯示ZNF545甲基化陽(yáng)性組65歲老年患者居多(P0.05)，多因素分析結(jié)果表明ZNF545甲基化雖然與12個(gè)臨床因素均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)(P0.05)，但ZNF545甲基化表達(dá)陽(yáng)性組肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率和死亡率均呈明顯增高趨勢(shì)。2、臨床對(duì)照研究：隨訪(fǎng)期為2～51.8月(中位時(shí)間19.8月)。(1)超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮水冷MWA較水冷RFA治療HCC需要更少的消融針數(shù)、消融次數(shù)、穿刺針數(shù)、消融時(shí)間和治療費(fèi)用(P0.05)，兩組具有相似的TER、LTP、肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移率、并發(fā)癥發(fā)生率和中期生存率(P0.05)，但MWA在臨近血管、胃腸、膈肌處腫瘤和3～5cm腫瘤消融中具有略好的局部腫瘤控制能力。(2)超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮水冷熱消融與手術(shù)切除治療HCC相比，TER、LTP、中期生存率比較無(wú)顯著差異(P0.05)，但手術(shù)治療在3～5cm腫瘤中體現(xiàn)了更好的局部控制能力。消融組嚴(yán)重并發(fā)癥的數(shù)量、種類(lèi)和嚴(yán)重程度優(yōu)于手術(shù)，需要更短的住院時(shí)間和更少的治療費(fèi)用(P0.05)，體現(xiàn)了經(jīng)皮消融治療的微創(chuàng)性。 結(jié)論：1、表觀遺傳研究：ZNF545基因甲基化是肝癌的頻發(fā)事件，ZNF545基因的表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)控，并抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。ZNF545基因的甲基化具有促進(jìn)早期肝癌消融后肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和死亡增加趨勢(shì)，提示ZNF545甲基化是一個(gè)潛在的肝癌診斷及預(yù)后的指標(biāo)，尚需大樣本長(zhǎng)隨訪(fǎng)病例以進(jìn)一步明確ZNF545在不同分期肝癌熱消融后的預(yù)測(cè)價(jià)值。上述基礎(chǔ)及臨床研究為揭示肝癌熱消融聯(lián)合表觀遺傳治療奠定了理論基礎(chǔ)。2、臨床對(duì)照研究：在早期HCC的治療中，(1)經(jīng)皮水冷MWA和RAF取得了相似的中期療效，但MWA在鄰近重要結(jié)構(gòu)的腫瘤和較大腫瘤消融中在局部腫瘤控制能力方面略占優(yōu)勢(shì)，MWA較RFA需要更少的治療時(shí)間、次數(shù)和費(fèi)用，減少了創(chuàng)傷，節(jié)約了醫(yī)療資源。(2)經(jīng)皮水冷熱消融治療與手術(shù)切除取得了相似的中期生存療效，雖然手術(shù)治療對(duì)于較大腫瘤局部控制能力優(yōu)于消融治療，但消融體現(xiàn)了其微創(chuàng)、廉價(jià)、可重復(fù)治療的優(yōu)勢(shì)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R445.1;R735.7
【圖文】：

解 放軍 醫(yī)學(xué) 院 博 士學(xué) 位論 文因子 來(lái) 調(diào)控 基因 的 轉(zhuǎn)錄 。 ZF P 可 以分 為許 多 亞家 族 ，其 中 Kr ü pp e l -l i ke ( C ys 2H i s 2， C 2H 2 ) 型 ZF P 是 其最 大 的 亞 家 族 ， 而 C 2 H2 型 ZN F 又 可 以 根 據(jù) 其 N 端 含 有 的 結(jié) 構(gòu) 域 分 成 4 大 類(lèi) ：FA X ( f i ng e r- a s s oc o a t ed bo xe s ) 型 ， FA R (f i n ge r - a s s oc i at ed re p e at s ) 型 ， P OZ ( po x vi ran d z in c fi ng er s ) 和 KR AB (K r ü p p el -a s s oc i at ed b ox ) 型 。 含 KR AB 結(jié) 構(gòu) 域 的 ZF P 也 稱(chēng)KR AB - Z F P ，結(jié) 構(gòu) 特征 是 N端 含有 KR AB 結(jié)構(gòu) 域， C 端含 有多 個(gè) C 2 H2 型 鋅指 結(jié) 構(gòu) ， 這 個(gè) 家 族 的 某 些 成 員 在N 端 還 含 有 一 個(gè)S C AN 結(jié) 構(gòu) 域 ( 圖 1 -1 ) 。 KR AB -Z F P 占 人 類(lèi) 基因 組 中 所 有 ZF P (7 99 種 ) 的 三 分 之 一 ， 是 哺 乳 動(dòng) 物 中 最 大 的 轉(zhuǎn) 錄 調(diào) 控 因 子 家 族 ， 在胚胎 發(fā) 育 、細(xì) 胞 分 化 、細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 化及 細(xì) 胞 周期 的 調(diào) 控 中發(fā) 揮 重 要功 能 ， 并 隨時(shí) 間 和 空間 的 不同 進(jìn)行 特 異表 達(dá) [ 5] 。

解 放軍 醫(yī)學(xué) 院 博 士學(xué) 位論 文探索 ， 研 究發(fā) 現(xiàn) ZN F 5 45 由 于啟 動(dòng) 子 甲基 化 而通 常在 胃 癌 組 織中 沉 默 或 低表 達(dá) ， 是胃 癌 的 抑癌 基 因 ， 其抗 腫 瘤 生 成功 能 是 通過(guò) 直 接 結(jié) 合到 rD N A 啟動(dòng) 子上 、 誘 導(dǎo) 組蛋 白修 飾 、招募 共 抑 制體 和 異 染 色蛋 白 體 1b 以及 減 少 rD N A 區(qū)組 蛋 白 H3 第四 位 賴(lài) 氨 酸 (H 3 K 4 ) 殘 基 的 三 甲 基 化 ( 降 低 H3 K 4 的 轉(zhuǎn) 錄 活 性 ) 從 而 抑 制 rR NA 轉(zhuǎn) 錄 調(diào)節(jié)。 ZN F 5 4 5 在胃 癌組 織 中甲 基化 率 達(dá) 到 51 . 9% ， 其甲 基 化 導(dǎo)致 胃 癌患 者生 存 期 顯 著 縮 短[ 6] ， 這 一 初 步 研 究 結(jié) 果 是 目 前 唯 一 有 關(guān) ZN F 5 4 5 基 因 與 腫 瘤 發(fā) 生 關(guān) 系 的 報(bào)道， 卻 未能 對(duì) 該基 因 的表 觀 遺傳 學(xué) 調(diào)控 機(jī) 制進(jìn) 行 研究 。

并 對(duì) 測(cè)序 結(jié)果 用 Bi oE d i t 生物 學(xué) 軟 件進(jìn) 行 序列 對(duì)比 ， 并 繪 結(jié) 果在肝 癌細(xì) 胞 系中 的 甲基 化 改 變 準(zhǔn)對(duì) 照 為 IV D， 即僅 能 擴(kuò) 增出 甲 基 化條 帶 ； 非甲 基 化 標(biāo)準(zhǔn) 對(duì) 照 h oc y t e DN A , NL )為 正 常人 外 周血 淋 巴細(xì) 胞 DN A ，即僅 能擴(kuò) 增 出非 甲 應(yīng) 產(chǎn) 物于 2% 的 瓊脂 糖凝 膠 上 進(jìn) 行電 泳 ，大小 位于 10 0～ 2 00 bp 之間 ， 小符 合 (圖 1- 3 )。 8 株細(xì) 胞 系( H e p G 2、 S M M C 7 72 1 、S UN 4 4 9 、 LC -P R F- 5 、S K- H e p 1 、 BE L 7 40 2 、L O 2 )M S P 結(jié)果 顯示 ： HB X F 34 4 B E L 7 40 2 為部 分甲 基 化 ， 其余 6 株細(xì) 胞系 為 完 全 甲基 化 ( 圖 1- 4 ) 。 IV D H2 O NL MK U M U M U M

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2781662