【摘要】：背景: 細(xì)胞移植是近年眾多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),干細(xì)胞移植至今已有30多年的歷史,并且已經(jīng)從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)逐漸向臨床應(yīng)用過渡。Asahara等首次從人外周血中分離到一類可以分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的特殊血細(xì)胞,將它命名為循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs),并利用小鼠模型證明了骨髓源性的EPCs參與了出生后血管生成。隨后的研究表明,EPCs在血管組織工程、冠心病治療、腫瘤研究、創(chuàng)傷愈合等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。鑒于EPCs潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值,有望通過移植EPCs治愈或改善某些疾病,提高病患的生活質(zhì)量或生存率,但移植細(xì)胞的活體示蹤及進(jìn)一步的療效觀察一直是面臨的難題。本研究采用超順磁性氧化鐵類(ultrasmall superparamagnetic iron oxide/ Ferumoxides、P7228)和順磁性釓Gd(Ⅲ)離子大分子螯合物(Gd-BOPTA)標(biāo)記EPCs進(jìn)行體外MR成像研究,探討EPCs標(biāo)記方法及體外MR成像的的最佳參數(shù),為采用EPCs的在體實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。 目的:探討人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定的方法,比較不同接種濃度對EPCs生長的影響,得出最佳接種濃度,為EPCs相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用搭建平臺(tái);探討Ferumoxides(FE)、P7228和Gd-BOPTA標(biāo)記EPCs的方法及不同濃度、不同標(biāo)記時(shí)間對細(xì)胞活性、粘附、遷移、增殖等生物學(xué)特性的影響,明確三者標(biāo)記EPCs的最佳濃度和標(biāo)記時(shí)間,為下一步實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù);探討Ferumoxides、P7228與Gd-BOPTA標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外磁共振成像特點(diǎn),明確標(biāo)記EPCs的最佳磁性對比劑和最合適的掃描序列,以期為磁性標(biāo)記EPCs在體內(nèi)的示蹤研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法: 1.人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性研究取健康產(chǎn)婦(均知情同意)順產(chǎn)或剖腹產(chǎn)臍帶血,與DPBS1:1稀釋,采用密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞,將其制成不同的濃度接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中,觀察細(xì)胞貼壁情況和集落形成情況;培養(yǎng)3天后用PBS液洗掉非貼壁細(xì)胞,換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至第7天,以后每隔3天更換培養(yǎng)液,倒置相差顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞生長情況。多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs,流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志物進(jìn)一步鑒定EPCs。采用改良的Boyden Chamber小室、粘附能力測定實(shí)驗(yàn)分別觀察細(xì)胞的遷移能力和粘附能力。 2.人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞Ferumoxides、P7228與Gd-BOPTA標(biāo)記及標(biāo)記細(xì)胞的生物學(xué)特性研究 以多聚左旋賴氨酸(PLL)和jetPEITM-FluoF為介質(zhì)分別介導(dǎo)FE、P7228和Gd-BOPTA標(biāo)記EPCs,介質(zhì)與標(biāo)記物混合比例為1:0.03,室溫下振蕩1h,配制的復(fù)合物加入培養(yǎng)基中使FE、P7228和GdBOPTA的終濃度為5μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、37.5μg/ml和50μg/ml,相應(yīng)的介質(zhì)PLL和jetPEITM-FluoF的終濃度為0.15μg/ml、0.375μg/ml、0.75μg/ml、1.125μg/ml和1.5μg/ml,復(fù)合物標(biāo)記時(shí)間分別為24h、48h和72h。采用普魯士藍(lán)染色、熒光顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察鐵顆粒、Gd顆粒在細(xì)胞內(nèi)的位置及不同標(biāo)記濃度和標(biāo)記時(shí)間條件下的標(biāo)記率。臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)了解標(biāo)記后細(xì)胞的生長活性,采用MTT比色法、改良的Boyden Chamber小室、粘附能力測定實(shí)驗(yàn)分別觀察標(biāo)記后細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和粘附能力。 3.Ferumoxides、P7228與Gd-BOPTA標(biāo)記的人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外MR研究消化、收集未標(biāo)記和不同濃度的FE、P7228和Gd-BOPTA標(biāo)記24h的EPCs于1.5mlEP管內(nèi),采用SE序列、快速自旋回波序列(FSE)、梯度回波(GRE)序列行MR掃描,測量不同標(biāo)記物在不同濃度條件下標(biāo)記的細(xì)胞在不同掃描序列中的信號(hào)強(qiáng)度變化,以未標(biāo)記細(xì)胞為參照,比較標(biāo)記細(xì)胞的信號(hào)變化百分比。 結(jié)果: 1.人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性研究單個(gè)核細(xì)胞接種24h后,細(xì)胞已有貼壁,細(xì)胞呈小圓形,培養(yǎng)3天后貼壁細(xì)胞開始變大、透亮度增強(qiáng)并出現(xiàn)梭形細(xì)胞。第7天,細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞數(shù)量增多、出現(xiàn)較多的梭形細(xì)胞和形態(tài)均一的細(xì)胞增殖集落,至14天,可見細(xì)胞呈“鋪路石”樣排列。其中以2.5×106個(gè)/ml的濃度接種培養(yǎng)可獲得良好的貼壁細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞集落數(shù)。第7天,多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPC,雙染色陽性細(xì)胞百分率為95%;流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)志物CD34、AC133、VEGFR2(KDR)的陽性表達(dá)率分別為(1.67±0.35%)、(12.63±9.70%)、(66.81±6.63%)。粘附能力和遷移能力檢測結(jié)果分別為(33.7±1.6)個(gè)、(29.2±1.2)個(gè)。 2.人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞Ferumoxides、P7228與Gd-BOPTA標(biāo)記及標(biāo)記細(xì)胞的生物學(xué)特性研究 普魯士藍(lán)染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞胞漿內(nèi)可見藍(lán)色顆粒,且隨著標(biāo)記濃度增高和標(biāo)記時(shí)間的延長,細(xì)胞內(nèi)聚集的鐵顆粒增多,細(xì)胞的標(biāo)記率也增高,P7228的標(biāo)記率高于FE ,FE、P7228(濃度為25μg/ml)的12h、24h標(biāo)記率分別為(91.3±0.59%)、(93.2±0.37%)和(96.7±1.21%)、(97.0±1.1%)。透射電鏡觀察,胞質(zhì)內(nèi)散在分布較多含膜的囊泡樣包涵體結(jié)構(gòu),且囊泡樣結(jié)構(gòu)隨著濃度增加和標(biāo)記時(shí)間延長相應(yīng)增多。 熒光顯微鏡下觀察,Gd-BOPTA標(biāo)記的EPCs胞質(zhì)內(nèi)可見綠色熒光顆粒,透射電鏡可見胞質(zhì)內(nèi)散在分布許多Gd顆粒,顆粒主要位于胞質(zhì)的胞器如高爾基體周圍以及附著在細(xì)胞膜內(nèi)層上。Gd-BOPTA標(biāo)記規(guī)律呈“拋物線”樣,即隨著標(biāo)記濃度增高和標(biāo)記時(shí)間的延長,細(xì)胞內(nèi)聚集的Gd顆粒增多,細(xì)胞的標(biāo)記率也增高,但在濃度為25μg/ml標(biāo)記24h標(biāo)記率達(dá)峰值后,標(biāo)記率逐漸降低,Gd-BOPTA在濃度為12.5μg/ml、25μg/ml、37.5μg/ml的12h、24h標(biāo)記率分別(55.7±0.79%)、(80.8±0.51%)、(71.6±0.64%)和(67.4±1.67%)、(88.2±1.56%)、(73.2±2.17%),標(biāo)記效率低于同條件下的FE和P7228。 FE、P7228和Gd-BOPTA(濃度為25μg/ml、37.5μg/ml和25μg/ml)標(biāo)記24h后EPCs的細(xì)胞活力分別為92.4%、89.5%和93.7%;三種標(biāo)記物的標(biāo)記濃度在低于25μg/ml、37.5μg/ml和25μg/ml時(shí),對細(xì)胞的粘附能力、遷移能力及增殖能力均無影響(P 0.05)。 3.Ferumoxides、P7228與Gd-BOPTA標(biāo)記的人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外MR研究T1WI序列:濃度增高,FE組、P7228組相對信號(hào)強(qiáng)度增大不明顯,無顯著性差異(P0.05);而Gd-BOPTA組相對信號(hào)強(qiáng)度增大明顯,最大相對信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)在濃度為25μg/ml時(shí)(161%),而后信號(hào)降低,與對照管相比差異顯著(P0.05)。 T2WI和T2*WI序列:相對信號(hào)強(qiáng)度隨FE、P7228濃度增加而迅速降低,T2*WI序列上P7228在濃度為50μg/ml時(shí)幾乎無信號(hào)顯示。FE、P7228濃度為5μg/ml時(shí),與對照管信號(hào)強(qiáng)度差異明顯(P0.05),其信號(hào)變化率分別為-10.4%、-17.8%和-12.3%、-34.9%。T2*WI上信號(hào)變化較T2WI上明顯,P7228較FE信號(hào)改變更為明顯,在T2*WI序列上磁共振信號(hào)隨FE-PLL、P7228-PLL復(fù)合物濃度的增加而降低(r= -0.681、-0.712,P0.05)。與T1WI序列比較,Gd-BOPTA組相對信號(hào)強(qiáng)度變化不明顯,兩種掃描方法所得結(jié)果無顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論: 1.采用Ficoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法可以較好地分離人臍血EPCs并獲得細(xì)胞純度和存活率較高的單個(gè)核細(xì)胞,細(xì)胞功能保持良好,以2.5×106個(gè)/ml的濃度接種培養(yǎng)可獲得良好的細(xì)胞分化和增殖。 2.以PLL為介質(zhì)的FE、P7228和以jetPEITM-FluoF為介質(zhì)的Gd-BOPTA均可有效地標(biāo)記EPCs,在一定的濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞的生物活性無影響。FE、P7228和Gd-BOPTA的最適標(biāo)記濃度分別為25μg/ml、37.5μg/ml和25μg/ml,最佳標(biāo)記時(shí)間為24h。 3.FE、P7228、Gd-BOPTA三種MR對比劑皆可簡單有效地標(biāo)記EPCs。FE、P7228對MR信號(hào)的影響主要為T2WI和T2*WI效應(yīng),T2WI和T2*WI序列對檢測超順磁性氧化鐵類具有特異性,可以粗略反映對比劑量的變化,濃度越高T2*WI序列負(fù)性效應(yīng)越明顯,以P7228成像效果較佳,T2*WI序列為此類對比劑的最佳磁共振檢查序列。順磁性釓螯合物(Gd-BOPTA)對MR信號(hào)的影響主要為T1WI效應(yīng),濃度越高正性效應(yīng)越明顯,但信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最大值后,隨著濃度的增加正性效應(yīng)減弱,說明Gd-BOPTA標(biāo)記細(xì)胞存在最適標(biāo)記濃度。 4.與順磁性釓類對比劑相比,超順磁性氧化鐵類對比劑標(biāo)記細(xì)胞方法簡單易行,且效果較佳;超順磁性氧化鐵類對比劑中P7228的標(biāo)記效率高于FE,對標(biāo)記細(xì)胞生物活性的影響較FE小,且MR信號(hào)變化較FE敏感,更適合于細(xì)胞的標(biāo)記。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R445.2;R457
【圖文】：

血漿血液 單個(gè)核細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離液淋巴細(xì)胞分離液 紅、白細(xì)胞圖 1-A 圖 1-B圖 1-1 密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞。1-A 血液與 Histopaque-1077 淋巴細(xì)胞分離液的界面；1-B 離心后臍血單個(gè)核細(xì)胞的血液分層。

血漿血液 單個(gè)核細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離液淋巴細(xì)胞分離液 紅、白細(xì)胞圖 1-A 圖 1-B圖 1-1 密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞。1-A 血液與 Histopaque-1077 淋巴細(xì)胞分離液的界面；1-B 離心后臍血單個(gè)核細(xì)胞的血液分層。

圖 1-5 第 7 天貼壁梭形細(xì)胞首尾相接形成的“線樣”結(jié)構(gòu)（×200）圖 1-6 第 14 天貼壁細(xì)胞呈“鋪路石”樣（×10A 攝取 DiI-acLDL（紅色，激發(fā)波長 543nm）B 結(jié)合 FITC-UEA-1（綠色，激發(fā)波長 477nm）

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊志軍,徐如祥,姜曉丹,柯以銓,魏黎,雷皓,溫志波,曹容,段麗,饒志仁,魏玲,蔡穎謙,杜謀選,鄒雨汐;菲立磁標(biāo)記大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞及自體移植后磁共振示蹤的研究[J];中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志;2005年02期

2 許乙凱,顏江華,張嘉寧,劉杏元,黃其鎏;標(biāo)記抗人肺癌單抗超順磁性氧化鐵粒子的磁共振免疫顯像實(shí)驗(yàn)[J];臨床放射學(xué)雜志;1998年05期

3 朱文珍;李祥;唐洲平;朱遂強(qiáng);漆劍頻;魏黎;雷浩;;Superparamagnetic Iron Oxide Labeling of Neural Stem Cells and 4.7T MRI Tracking in vivo and in vitro[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2007年01期

4 張懷勤,季亢挺,楊德業(yè),黃曉燕,林捷,黃偉劍,徐力辛;內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)條件的正交設(shè)計(jì)研究[J];溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2005年04期

5 肖剛峰;張懷勤;季亢挺;鄧武;黃曉燕;;單個(gè)核細(xì)胞的接種密度對貼壁篩選法培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2006年02期

6 王興祥,朱軍慧,陳君柱,嚴(yán)卉,朱建華,孫堅(jiān),尚云鵬,郭曉綱;成人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、擴(kuò)增及鑒定[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2005年01期

7 居勝紅,滕皋軍,毛曦,張愛鳳,張宇,馬明,顧寧;臍血間充質(zhì)干細(xì)胞磁探針標(biāo)記和MR成像研究[J];中華放射學(xué)雜志;2005年01期

8 王爽,謝鵬,牟君,趙裕光,賈延R

本文編號(hào)：2770976