【摘要】：心肌肌鈣蛋白I(cTnI)是組成心肌肌鈣蛋白復(fù)合物的亞單位之一，具有高度的心肌特異性，被認(rèn)為是診斷心肌損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。快速、靈敏、準(zhǔn)確測(cè)定人血中的cTnI對(duì)于診斷急性心肌梗死、急性冠狀動(dòng)脈綜合征的危險(xiǎn)分層、監(jiān)測(cè)各種因素所導(dǎo)致的心肌損傷、以及心臟事件的判斷預(yù)后等有著重要的意義。 目前，測(cè)定cTnI的方法主要有放射性同位素免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)、熒光免疫分析法(FIA)、以及金標(biāo)免疫分析法等。其中，RIA法因有放射性污染的危險(xiǎn)已基本不使用；CLIA法和FIA法靈敏度較高，但儀器價(jià)格偏高，國(guó)內(nèi)在這方面的研究相對(duì)較少；金標(biāo)免疫分析法主要應(yīng)用于制作定性分析用的免疫層析試紙條，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)各醫(yī)院多使用國(guó)外公司的產(chǎn)品，價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)學(xué)者雖在這方面有不少研究，但其靈敏度不高，難以推向市場(chǎng)；目前國(guó)內(nèi)研究和應(yīng)用最多的方法是ELISA，該方法靈敏度適中，使用相對(duì)簡(jiǎn)便，儀器價(jià)格也不很高，但存在測(cè)定周期偏長(zhǎng)、靈敏度相對(duì)較低、檢測(cè)范圍較窄等不足。 考慮到檢測(cè)人血液中cTnI對(duì)于判斷心肌損傷的重要性，以及目前國(guó)內(nèi)測(cè)定cTnI的方法所存在的這樣或那樣的缺陷，本論文從快速、靈敏、準(zhǔn)確測(cè)定和降低檢測(cè)成本等方面入手，綜合應(yīng)用納米金標(biāo)記技術(shù)、納米孔材料上的生物分子固定化技術(shù)、以及高靈敏的電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，建立了幾種測(cè)定人cTnI的方法，彌補(bǔ)了現(xiàn)有方法的某些不足。具體內(nèi)容如下： 1．金標(biāo)銀染法快速檢測(cè)人血清中cTnI的研究 納米金具有特殊的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)，生物相容性好，是繼放射性同位素、酶、 發(fā)光(熒光)物質(zhì)之后的又一種卓越的免疫標(biāo)記物質(zhì)，銀染技術(shù)的引進(jìn)使其可見性得以顯著提高，從而使免疫檢測(cè)的靈敏度隨之大幅度提高。本文以硝酸纖維膜作為基底，結(jié)合一步法雙單克隆抗體夾心技術(shù)、低密度蛋白芯片技術(shù)、納米金探針技術(shù)、以及納米金顆粒上的銀染放大技術(shù)建立了一種檢測(cè)人心肌肌鈣蛋白I的快速測(cè)定法。方法具有極高的特異性，當(dāng)血清樣品中心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、肌紅蛋白(Mb)、以及骨骼肌肌鈣蛋白I(sTnI)的濃度分別高達(dá)0.2 μg／mL、100 μg／mL、以及30 μg／mL時(shí)，仍然不干擾cTnI的測(cè)定和判斷；檢測(cè)速度快，能在40分鐘內(nèi)報(bào)告測(cè)定結(jié)果；耗樣量少，一次測(cè)定只需要10 μL血清樣本；方法重復(fù)性好，同一樣品在同一塊基片上的測(cè)定結(jié)果的批內(nèi)變異系數(shù)(n=8)以及不同時(shí)間在不同基片上的測(cè)定結(jié)果的批間變異系數(shù)(n=8)均小于20％；通過對(duì)200例正常人血清標(biāo)本的測(cè)定獲得了該方法的臨界值(CUT-OFF)為0.3 ng／mL，以此臨界值作為判斷依據(jù)測(cè)定了588例病人血清中的cTnI含量，同時(shí)與ELISA法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較(采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件)，顯示兩種方法的測(cè)定結(jié)果間差異不具有顯著性意義(P=0.66；一般認(rèn)為當(dāng)P＞0.05時(shí)，兩種方法之間的差異不具有顯著性意義)，由兩種方法判斷所得結(jié)果的符合率為86％。 2．測(cè)定人cTnI的陽(yáng)極溶出伏安法研究 介孔分子篩具有比表面積大、孔徑與生物分子尺寸相當(dāng)、表面基團(tuán)豐富并易功能化和孔道結(jié)構(gòu)規(guī)則有序等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，是制作化學(xué)修飾電極、固定生物活性分子的理想材料。本文首次以分子篩作為修飾劑制備碳糊修飾電極用于固定抗體分子，并以該修飾電極結(jié)合抗原抗體的雙抗體夾心反應(yīng)、納米金標(biāo)記抗體技術(shù)、納米金上的銀增強(qiáng)技術(shù)、以及陽(yáng)極溶出伏安法等方法和技術(shù)，建立了一種測(cè)定人血清中cTnI的電化學(xué)免疫分析新方法，并進(jìn)行了其應(yīng)用的可行性分析。實(shí)驗(yàn)表明，在分子篩修飾制備的修飾電極上相對(duì)于純碳糊電極上陽(yáng)極溶出峰電流信號(hào)有顯著增強(qiáng)，在SBA-15(孔徑9.19 nm)修飾碳糊電極(SBA-MCPE)、MCM-41(孔徑3.10 nm)修飾碳糊電極(MCM-MCPE)、Y型分子篩(孔徑0.74 nm)修飾碳糊電極(Y-MCPE)、以及未經(jīng)修飾處理的純碳糊電極(CPE)上的峰電流比值約為10∶7∶2∶1，顯示分子篩對(duì)抗體分子的固定能力與分子篩的孔徑正相關(guān)；采用單因素變化法優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，銀的陽(yáng)極溶出峰電流信號(hào)與血清中cTnI的濃度在0.5～5.0 ng／mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Ip(μA)=1.0 +3.5 C(ng／mL)，相關(guān)系數(shù)R~2=0.98，方法檢出限為0.2 ng／mL：對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果與ELISA法的測(cè)定結(jié)果基本吻合。 3．化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法檢測(cè)人血清中cTnI的研究 化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)是一種高靈敏度的免疫分析法，其檢測(cè)靈敏度可與RIA法相媲美。本文在傳統(tǒng)的ELISA法的基礎(chǔ)上，在進(jìn)行免疫反應(yīng)后，改用高效的化學(xué)發(fā)光試劑3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基4-(3”-羥基)苯-1，2-二氧雜環(huán)丁烷磷酸(AMPPD)作為檢測(cè)底物，并且將傳統(tǒng)的兩步雙抗夾心法改為一步法進(jìn)行免疫反應(yīng)，建立了一種高靈敏度的測(cè)定人血清中cTnI的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法。采用單因素變化法和方陣滴定法得到的最佳實(shí)驗(yàn)條件為：捕獲抗體包被濃度選擇10 μg／mL，選擇pH 7.0的PBS作為免疫反應(yīng)緩沖底液，以含1％ BSA的pH 9.6碳酸鹽緩沖液4℃封閉過夜，生物素-檢測(cè)抗體(Biotin-IgG_2)以及堿性磷酸酶-親和素(ALP-Avidin)結(jié)合物的稀釋度均采用1∶2000，免疫反應(yīng)條件為37℃孵育60 min，以去離子水作為洗滌劑，以1∶100稀釋的AMPPD作為發(fā)光反應(yīng)底物，選擇發(fā)光反應(yīng)時(shí)間為10 min(37℃)。方法充分發(fā)揮了化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，具有很高的靈敏度，檢出限為0.02 ng／mL，比傳統(tǒng)的ELISA法檢測(cè)限降低一個(gè)數(shù)量級(jí)以上；檢測(cè)速度較快，整個(gè)測(cè)定周期約75 min，比傳統(tǒng)的兩步法ELISA快得多；檢測(cè)范圍寬(0.04～36.2 ng／mL)，比傳統(tǒng)ELISA法擴(kuò)寬了近兩個(gè)數(shù)量級(jí)；方法準(zhǔn)確可靠，加標(biāo)試驗(yàn)回收率介于97.5％～102.8％之間，對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果與ELISA法的測(cè)定結(jié)果相吻合；重復(fù)性好，三個(gè)樣品的批內(nèi)變異系數(shù)均小于8.5％(n=12)，批間平均變異系數(shù)小于15％(n=8)。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R817.4;R446.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2754073