發(fā)布時間：2020-07-13 22:30

【摘要】：心肌肌鈣蛋白I(cTnI)是組成心肌肌鈣蛋白復(fù)合物的亞單位之一，具有高度的心肌特異性，被認(rèn)為是診斷心肌損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。快速、靈敏、準(zhǔn)確測定人血中的cTnI對于診斷急性心肌梗死、急性冠狀動脈綜合征的危險分層、監(jiān)測各種因素所導(dǎo)致的心肌損傷、以及心臟事件的判斷預(yù)后等有著重要的意義。 目前，測定cTnI的方法主要有放射性同位素免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)、熒光免疫分析法(FIA)、以及金標(biāo)免疫分析法等。其中，RIA法因有放射性污染的危險已基本不使用；CLIA法和FIA法靈敏度較高，但儀器價格偏高，國內(nèi)在這方面的研究相對較少；金標(biāo)免疫分析法主要應(yīng)用于制作定性分析用的免疫層析試紙條，現(xiàn)在國內(nèi)各醫(yī)院多使用國外公司的產(chǎn)品，價格昂貴，國內(nèi)學(xué)者雖在這方面有不少研究，但其靈敏度不高，難以推向市場；目前國內(nèi)研究和應(yīng)用最多的方法是ELISA，該方法靈敏度適中，使用相對簡便，儀器價格也不很高，但存在測定周期偏長、靈敏度相對較低、檢測范圍較窄等不足。 考慮到檢測人血液中cTnI對于判斷心肌損傷的重要性，以及目前國內(nèi)測定cTnI的方法所存在的這樣或那樣的缺陷，本論文從快速、靈敏、準(zhǔn)確測定和降低檢測成本等方面入手，綜合應(yīng)用納米金標(biāo)記技術(shù)、納米孔材料上的生物分子固定化技術(shù)、以及高靈敏的電化學(xué)檢測技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)，建立了幾種測定人cTnI的方法，彌補了現(xiàn)有方法的某些不足。具體內(nèi)容如下： 1．金標(biāo)銀染法快速檢測人血清中cTnI的研究 納米金具有特殊的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)，生物相容性好，是繼放射性同位素、酶、 發(fā)光(熒光)物質(zhì)之后的又一種卓越的免疫標(biāo)記物質(zhì)，銀染技術(shù)的引進使其可見性得以顯著提高，從而使免疫檢測的靈敏度隨之大幅度提高。本文以硝酸纖維膜作為基底，結(jié)合一步法雙單克隆抗體夾心技術(shù)、低密度蛋白芯片技術(shù)、納米金探針技術(shù)、以及納米金顆粒上的銀染放大技術(shù)建立了一種檢測人心肌肌鈣蛋白I的快速測定法。方法具有極高的特異性，當(dāng)血清樣品中心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、肌紅蛋白(Mb)、以及骨骼肌肌鈣蛋白I(sTnI)的濃度分別高達0.2 μg／mL、100 μg／mL、以及30 μg／mL時，仍然不干擾cTnI的測定和判斷；檢測速度快，能在40分鐘內(nèi)報告測定結(jié)果；耗樣量少，一次測定只需要10 μL血清樣本；方法重復(fù)性好，同一樣品在同一塊基片上的測定結(jié)果的批內(nèi)變異系數(shù)(n=8)以及不同時間在不同基片上的測定結(jié)果的批間變異系數(shù)(n=8)均小于20％；通過對200例正常人血清標(biāo)本的測定獲得了該方法的臨界值(CUT-OFF)為0.3 ng／mL，以此臨界值作為判斷依據(jù)測定了588例病人血清中的cTnI含量，同時與ELISA法的測定結(jié)果進行比較(采用SPSS 11.0統(tǒng)計分析軟件)，顯示兩種方法的測定結(jié)果間差異不具有顯著性意義(P=0.66；一般認(rèn)為當(dāng)P＞0.05時，兩種方法之間的差異不具有顯著性意義)，由兩種方法判斷所得結(jié)果的符合率為86％。 2．測定人cTnI的陽極溶出伏安法研究 介孔分子篩具有比表面積大、孔徑與生物分子尺寸相當(dāng)、表面基團豐富并易功能化和孔道結(jié)構(gòu)規(guī)則有序等獨特的優(yōu)點，是制作化學(xué)修飾電極、固定生物活性分子的理想材料。本文首次以分子篩作為修飾劑制備碳糊修飾電極用于固定抗體分子，并以該修飾電極結(jié)合抗原抗體的雙抗體夾心反應(yīng)、納米金標(biāo)記抗體技術(shù)、納米金上的銀增強技術(shù)、以及陽極溶出伏安法等方法和技術(shù)，建立了一種測定人血清中cTnI的電化學(xué)免疫分析新方法，并進行了其應(yīng)用的可行性分析。實驗表明，在分子篩修飾制備的修飾電極上相對于純碳糊電極上陽極溶出峰電流信號有顯著增強，在SBA-15(孔徑9.19 nm)修飾碳糊電極(SBA-MCPE)、MCM-41(孔徑3.10 nm)修飾碳糊電極(MCM-MCPE)、Y型分子篩(孔徑0.74 nm)修飾碳糊電極(Y-MCPE)、以及未經(jīng)修飾處理的純碳糊電極(CPE)上的峰電流比值約為10∶7∶2∶1，顯示分子篩對抗體分子的固定能力與分子篩的孔徑正相關(guān)；采用單因素變化法優(yōu)化了實驗條件，銀的陽極溶出峰電流信號與血清中cTnI的濃度在0.5～5.0 ng／mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Ip(μA)=1.0 +3.5 C(ng／mL)，相關(guān)系數(shù)R~2=0.98，方法檢出限為0.2 ng／mL：對實際樣品的測定結(jié)果與ELISA法的測定結(jié)果基本吻合。 3．化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法檢測人血清中cTnI的研究 化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)是一種高靈敏度的免疫分析法，其檢測靈敏度可與RIA法相媲美。本文在傳統(tǒng)的ELISA法的基礎(chǔ)上，在進行免疫反應(yīng)后，改用高效的化學(xué)發(fā)光試劑3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基4-(3”-羥基)苯-1，2-二氧雜環(huán)丁烷磷酸(AMPPD)作為檢測底物，并且將傳統(tǒng)的兩步雙抗夾心法改為一步法進行免疫反應(yīng)，建立了一種高靈敏度的測定人血清中cTnI的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法。采用單因素變化法和方陣滴定法得到的最佳實驗條件為：捕獲抗體包被濃度選擇10 μg／mL，選擇pH 7.0的PBS作為免疫反應(yīng)緩沖底液，以含1％ BSA的pH 9.6碳酸鹽緩沖液4℃封閉過夜，生物素-檢測抗體(Biotin-IgG_2)以及堿性磷酸酶-親和素(ALP-Avidin)結(jié)合物的稀釋度均采用1∶2000，免疫反應(yīng)條件為37℃孵育60 min，以去離子水作為洗滌劑，以1∶100稀釋的AMPPD作為發(fā)光反應(yīng)底物，選擇發(fā)光反應(yīng)時間為10 min(37℃)。方法充分發(fā)揮了化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度檢測優(yōu)勢，具有很高的靈敏度，檢出限為0.02 ng／mL，比傳統(tǒng)的ELISA法檢測限降低一個數(shù)量級以上；檢測速度較快，整個測定周期約75 min，比傳統(tǒng)的兩步法ELISA快得多；檢測范圍寬(0.04～36.2 ng／mL)，比傳統(tǒng)ELISA法擴寬了近兩個數(shù)量級；方法準(zhǔn)確可靠，加標(biāo)試驗回收率介于97.5％～102.8％之間，對實際樣品的測定結(jié)果與ELISA法的測定結(jié)果相吻合；重復(fù)性好，三個樣品的批內(nèi)變異系數(shù)均小于8.5％(n=12)，批間平均變異系數(shù)小于15％(n=8)。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R817.4;R446.6

【參考文獻】

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本文編號：2754073