【摘要】：研究背景 本課題的目的是依托磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)檢測技術(shù)、為神經(jīng)干細胞(neuroal stem cells, NSCs)移植治療應(yīng)用的療效評估提供活體功能示蹤技術(shù)方法。 NSCs在神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)過程中具有重要學(xué)術(shù)價值,其中骨髓基質(zhì)細胞來源的NSCs (bone marrow stroma cells-derived NSCs, BMSCs-D-NSCs),因其來源豐富、取材方便并可自體移植而不涉及免疫排斥及倫理問題等優(yōu)勢,具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。本研究團隊在BMSCs-D-NSCs誘導(dǎo)分化及移植應(yīng)用研究方面取得了樂觀的前期實驗結(jié)果,為進一步研究NSCs移植修復(fù)神經(jīng)組織損傷的機制,還需要在細胞移植后的一定時間點對所移植NSCs在體內(nèi)的功能情況進行評估。 但迄今為止的各項技術(shù)(包括活體腦片膜片鉗技術(shù)等),均未在研究NSCs移植后、于宿主腦內(nèi)的功能評估方面獲得突破；對于所移植細胞是否可與活體神經(jīng)組織發(fā)生功能重組并發(fā)揮相關(guān)的功能尚無從確定。然而,BMSCs-D-NSCs活體內(nèi)功能的鑒定和評估對于其移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve system,CNS)損傷修復(fù)策略的實施應(yīng)用至關(guān)重要。根據(jù)本團隊相關(guān)前期研究工作結(jié)果及前述內(nèi)容的文獻搜索,無論從形態(tài)結(jié)構(gòu)、還是神經(jīng)電生理神經(jīng)生化的角度,都顯示了NSCs在體外的確具備神經(jīng)元樣細胞分化的能力；近期發(fā)展起來并成為研究領(lǐng)域熱切關(guān)注的誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPS)技術(shù),也從另一個側(cè)面提示了干細胞(包括NSCs)向神經(jīng)元方向發(fā)育分化并擁有相關(guān)神經(jīng)元功能的確定性。這些前期工作的發(fā)現(xiàn),都為我們進一步從事BMSCs-D-NSCs移植后的體內(nèi)功能評估研究提供了有利依據(jù),目前所需要的是一種更有效、更能直接活體評估移植NSCs在宿主體內(nèi)功能重建的示蹤方法。 一般情況下,體外標(biāo)記追蹤方面,通常用綠熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)或5-溴-2’-脫氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)作為待移植NSCs或其DNA的標(biāo)記物,經(jīng)標(biāo)本切片觀察進行評估分析。但這種對以GFP或BrdU標(biāo)記NSCs的追蹤觀察僅適用于體外分析或動物實驗,而就NSCs活體內(nèi)的分化及功能評估或未來臨床療效評估而言,探尋能直接評價移植NSCs在宿主體內(nèi)功能重建的活性示蹤方法更加重要。 在從結(jié)構(gòu)上活體示蹤移植干細胞的存活遷移研究方面,國外曾有借用超順磁氧化鐵(Superparamagnetic iron oxide, SPIO)活體標(biāo)記移植細胞修復(fù)心肌缺損評價的研究報道；本實驗室則較早借助于SPIO活體標(biāo)記手段對BMSCs-D-NSCs移植修復(fù)CNS損傷進行了研究,并取得樂觀的前期實驗結(jié)果。但這些標(biāo)記物結(jié)合影像學(xué)活體示蹤的內(nèi)容還僅是從結(jié)構(gòu)上追蹤移植細胞的存活、遷移,無法從功能上追蹤移植細胞在宿主神經(jīng)組織內(nèi)的功能狀態(tài)。 在從功能上活體評估和示蹤移植干細胞與宿主組織功能整合與功效研究方面,研究報道尚屬少見。以往采用的氟脫氧葡萄糖(fluorodeoxyglucose, FDG)正電子發(fā)射體層攝影(position emission tomography, PET)及血氧水平依賴(blood oxygen level-dependent, BOLD)磁共振(magnetic resonance imaging, MRI)成像方法只可提供區(qū)域腦組織活動的間接指標(biāo)信息-腦局部糖代謝變化,尚難以直接反映神經(jīng)活動變化,特別是尚無法在細胞水平上直接反映移植NSCs的功能活動。 由此,本實驗考慮應(yīng)用活性誘導(dǎo)錳離子(Mn2+)增強的磁共振(manganese enhancement MRI, MEMRI)技術(shù)對NSCs移植后分化神經(jīng)元功能評估。 活性誘導(dǎo)的MEMRI功能成像技術(shù)成像機制為Mn2+的化學(xué)性質(zhì)和離子半徑與鈣離子(Ca2+)相似,可以在神經(jīng)刺激發(fā)生時通過開放的電壓門控鈣離子通道進入相應(yīng)激活的核團或皮層,而Ca2+通道是參與突觸活動和相關(guān)神經(jīng)功能最主要的因素,因此Mn2+可以通過MRI形式實現(xiàn)對神經(jīng)元功能活動的觀察。經(jīng)全身性氯化錳(MnCl2)給藥并給予相關(guān)感覺刺激后,應(yīng)用MRI可以觀察到Mn2+在該感覺系統(tǒng)相應(yīng)核團及皮層聚集。 更有價值的是,Mn2+在神經(jīng)功能活動發(fā)生時可以迅速進入激活的神經(jīng)元,但是其在細胞內(nèi)的清除期卻較長。因此,通過延長神經(jīng)刺激時間和藥物維持時間,Mn2+可以在激活的神經(jīng)元中持續(xù)增加聚集,這種Mn2+顯像時程累積效應(yīng)將有助于從數(shù)以千萬計的移植細胞中捕捉到更細微、更瞬時的神經(jīng)元電活動,這也是該技術(shù)不同于既往的BOLD fMRI及活體腦片膜片鉗技術(shù)的優(yōu)勢所在,適用于移植NSCs分化為功能性神經(jīng)元后數(shù)量及功能活動少、且表現(xiàn)為瞬時狀態(tài)的特點。但是Mn2+增強功能成像技術(shù)仍處于發(fā)展階段,仍存在很多方法學(xué)上的問題。 首先,Mn2+的毒性問題是困擾NSCs移植后分化神經(jīng)元功能評估的重要影響因素之一。Mn2+具有急性和慢性的毒性作用。在MEMRI動物試驗中,急性毒性作用尤其不容忽視。其急性毒性主要表現(xiàn)在對心肌的作用,機制在于Mn2+可依賴于不同劑量而對Ca2+通道起到激活或阻滯的雙重作用,不同給藥劑量、給藥途徑和速度可以在不同程度上起到抑制心肌電傳遞系統(tǒng)的作用。既往的MEMRI功能成像試驗中,應(yīng)用的Mn2+劑量相對較高,并不適合于NSCs移植后分化神經(jīng)元的功能評估所需條件。因而通過各種方法降低該成像方法中應(yīng)用的Mn2+劑量是必需和首要的步驟,也是本研究著重關(guān)注的內(nèi)容之一 其次,MEMRI應(yīng)用T1加權(quán)序列信號強度作為反映Mn2+聚集濃度的指標(biāo)。雖然既往的研究顯示活體內(nèi)的Mn2+濃度變化與T1弛豫時間具有線性關(guān)系,然而T1加權(quán)信號強度不僅受到T1弛豫時間的影響,同時也會受到T2弛豫時間的影響。因此T1加權(quán)信號強度僅在一定Mn2+濃度范圍內(nèi)與其濃度成線性關(guān)系,這就需要對皮層的Mn2+濃度進行化學(xué)測量,從而進一步支持影像學(xué)結(jié)果,這種化學(xué)測量的方法研究也是必要的。本實驗從電感耦合等離子體質(zhì)譜分析方法的角度初步探索了支持影像學(xué)結(jié)果的化學(xué)檢測方法。 此外,MEMRI數(shù)據(jù)處理過程亦需完善,因該成像方法目前為止尚缺少統(tǒng)一的數(shù)據(jù)處理方法規(guī)程。本研究嘗試運用圖像配準(zhǔn)后平均化、數(shù)字減影及興趣區(qū)信號強度統(tǒng)計分析的方法,期望初步形成一套適用于影像學(xué)數(shù)據(jù)處理的方法規(guī)程。 總體而言,面向NSCs移植后分化神經(jīng)元樣細胞的活體功能評估,需要一套成熟有效的MEMRI功能成像方法。本課題目的即在于優(yōu)化MEMRI腦功能成像技術(shù)。其中最主要的方面在于,通過方法的改進減少應(yīng)用于MEMRI功能成像技術(shù)中的Mn2+劑量,建立支持影像學(xué)結(jié)果的化學(xué)檢測方法,以及建立合適的影像學(xué)數(shù)據(jù)處理方法規(guī)程。旨在通過以上實驗研究,初步建立一套較為成熟的、適合NSCs移植后分化神經(jīng)元樣細胞活體功能評估的成像及檢測方案。 第一部分大鼠原代皮層神經(jīng)元錳離子增強磁共振功能成像 目的：初探錳標(biāo)記神經(jīng)細胞功能活動的可行性,并初步探索以MEMRI成像評估NSCs移植后分化神經(jīng)元功能的細胞濃度與錳濃度。要進行NSCs移植分化神經(jīng)元的MEMRI功能評估,就需要對神經(jīng)元的錳吸收能力及成像的可行性及特性有一定認識,需要了解多大濃度的神經(jīng)元在多大濃度的錳離子干預(yù)下可以有效獲得增強成像的結(jié)果,該濃度的Mn2+對神經(jīng)元存活的影響也在考慮范圍之內(nèi)。為此,我們進行了原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元體外MEMRI成像初步研究,希望通過該前期研究,了解大鼠皮層神經(jīng)元對Mn2+的吸收能力、達到磁共振成像要求的條件、及其成像特點,為NSCs移植后、在中樞神經(jīng)組織內(nèi)分化的神經(jīng)元功能成像實驗提供依據(jù),也便于后續(xù)實驗中選擇合適數(shù)量的移植細胞及合適的Mn2+對比劑劑量。 方法：原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)及鑒定按常規(guī)方法進行。原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元分為“無錳干預(yù)對照組”及“MnCl2干預(yù)組”。MnCl2干預(yù)組又按添加MnCl2終濃度的不同而分為各濃度亞組(氯化錳干預(yù)組的各亞組,分別添加終濃度為0.05mMol/L、0.1 mMol/L、0.2mMol/L、0.5 mMol/L的MnCl2);無錳干預(yù)對照組則不添加MnCl2。添加MnCl2后24小時進行MTT檢測,以觀察不同濃度MnCl2對細胞存活率的影響。另設(shè)與以上相同組在添加MnCl2后,進行谷氨酸刺激,其中0.5 mMol/L MnCl2干預(yù)亞組設(shè)1個不進行谷氨酸刺激的對照,各組添加谷氨酸的終濃度為10μMol/L,經(jīng)MnCl2及谷氨酸雙重干預(yù)后24小時24小時、再以電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)檢測細胞內(nèi)的錳含量,并進行細胞磁共振成像實驗。數(shù)據(jù)資料統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS13.0軟件；計量資料的統(tǒng)計分析應(yīng)用單因素方差分析,組間兩兩比較應(yīng)用最小顯著差法(the least significant difference, LSD);統(tǒng)計水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果：原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元生長狀態(tài)良好,神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein, MAP-2)及Hochest33342雙染陽性。MTT結(jié)果中,方差齊性檢驗顯示對照組及四個濃度錳標(biāo)記組神經(jīng)元存活量測定方差齊性(Levene statistic=1.410, P=0.260),該五組神經(jīng)元存活量差異具有顯著性(F=162.696,P=0.000),應(yīng)用LSD法兩兩比較顯示,四個濃度錳標(biāo)記組與對照組比較神經(jīng)元存活量差異均具有顯著性(tab=18.508, Pab=0.000; tac=17.518, Pac=0.000; tad=21.340, Pad=0.000; tae=21.698, Pae=0.000),四個濃度的MnCl2標(biāo)記組神經(jīng)元存活量均低于對照組；0.2mMol/L、0.5mMol/L MnCl2標(biāo)記組神經(jīng)元存活量與0.05mMol/L、0.1mMol/L MnCl2標(biāo)記組神經(jīng)元存活量比較差異具有顯著性(tbd=2.833, Pbd=0.009; tbe=3.190, Pbe=0.004; tcd=3.823, Pcd=0.001; tce=4.180, Pce=0.000),0.2mM、0.5mM MnCl2標(biāo)記組神經(jīng)元存活量低于0.05mMol/L、0.1mM ol/LMnCl2標(biāo)記組；0.2mMol/L與0.5mMol/L MnCl2標(biāo)記組之間的神經(jīng)元存活量比較差異無顯著性(tde=0.358, Pde=0.724),0.05mMol/L與0.1mMol/LMnCl2標(biāo)記組之間的神經(jīng)元存活量比較差異亦無顯著性(tbc=-0.990, Pbc=0.332)。ICP-MS錳含量分析顯示,隨著標(biāo)記錳濃度的增高,神經(jīng)元內(nèi)錳含量也增高,加谷氨酸刺激組細胞內(nèi)錳含量(840ppm)高于無谷氨酸刺激組(140ppm)。不同濃度錳標(biāo)記細胞磁共振圖像顯示,0.1mMol/L、0.2mMol/L及0.5mMol/L MnCl2標(biāo)記組的磁共振信號強度有明顯增高,而且隨著標(biāo)記錳濃度的增高,磁共振T1加權(quán)序列信號強度也增加；0.5mMol/L MnCl2標(biāo)記組信號強度高于0.5mMol/L無谷氨酸刺激組。 結(jié)論及意義： 1、體外證實了錳標(biāo)記神經(jīng)細胞功能活動可行性,并初步建立了MEMR體外培養(yǎng)細胞功能成像及化學(xué)測定細胞內(nèi)錳含量的技術(shù)方法。 2、一定程度上提示了應(yīng)用MRMRI對移植NSCs分化神經(jīng)元進行功能成像的可行性,為下步MEMR成像NSCs移植后分化神經(jīng)元功能評估提供了可參照的細胞濃度與錳濃度。實驗中,應(yīng)用106/ml神經(jīng)元進行成像實驗,且需0.1mMol/L MnCl2才可獲得較明顯的磁共振增強效果,提示進行NSCs移植功能追蹤實驗時,移植細胞在體內(nèi)濃度應(yīng)高于106/ml,從而使實驗中可明顯增強MRI的可選濃度小于0.1mMol/L MnCl2。 第二部分：低劑量氯化錳大鼠視覺皮層磁共振功能成像 目的：除了MnCl2對神經(jīng)元活性的直接影響,后續(xù)的NSCs移植后分化神經(jīng)元活體內(nèi)功能追蹤實驗還需要注意的是,活體給予MnCl2時,MnCl2對大鼠的全身急性毒性作用。本實驗?zāi)康脑谟谔綄んw內(nèi)實驗中通過延長刺激時間充分發(fā)揮注射錳作用的方法,從而降低活體MEMRI實驗中所需錳量,減少其急性毒性作用,以利今后NSCs移植后分化神經(jīng)元活體內(nèi)功能評估。近期的MEMRI大鼠視覺皮層功能成像研究中,所應(yīng)用的MnC12劑量多為33mg/kg,且其增強差異效果需采用板層分析才能檢測到。課題組在既往研究中發(fā)現(xiàn),Mn2+在血腦屏障(blood brain barrier, BBB)關(guān)閉以后,仍存在著持續(xù)進入腦功能激活區(qū)的提示。本實驗?zāi)康募丛谟?研究錳成像過程中是否確實同步存在著Mn2+向激活區(qū)腦組織的遷移,從而通過在BBB關(guān)閉后延長刺激時間的方法,充分利用以低劑量注射的錳、從而減少錳的總應(yīng)用量。 方法：成年雄性Wistar大鼠(N=24只)均分為四組：視覺刺激組、無刺激組、半刺激組、靜脈注錳組。應(yīng)用36mg/ml水合氯醛按360mg/kg腹腔注射麻醉,麻醉生效后進行右側(cè)頸外動脈插管用于注射藥物。各組均在進行30%甘露醇7mg/kg右側(cè)頸外動脈注射以開放BBB后進行MnCl2給藥,其中視覺刺激組、無刺激組及半刺激組均由右側(cè)頸外動脈插管注射MnCl2,靜脈給錳組由尾靜脈注射MnCl2,用量均為5mg/kg。之后給予視覺刺激。各組視覺刺激處理如下：視覺刺激組大鼠放置于視覺刺激裝置中進行視覺刺激5小時；無刺激大鼠放置于暗室中靜置5小時；半刺激組大鼠先在視覺刺激裝置中進行刺激2小時再轉(zhuǎn)至暗室中靜置3小時；靜脈給錳組則先于暗室中靜置2小時再轉(zhuǎn)至視覺刺激裝置中刺激3小時。刺激后即進行磁共振數(shù)據(jù)獲取。獲取MEMRI圖像后處死大鼠取腦,應(yīng)用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)儀進行視覺皮層錳含量定量分析；應(yīng)用Matrix Laboratory (MATLB)、Statistical Parametric Mapping (SPM)、MRIcro軟件進行圖像后處理,過程主要包括圖像配準(zhǔn)、組內(nèi)圖像平均化、圖像減影及興趣區(qū)分析。數(shù)據(jù)資料統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS13.0軟件；計量資料的統(tǒng)計分析應(yīng)用單因素方差分析,方差不齊時組間差異比較應(yīng)用Welch法,組間兩兩比較方差齊性時應(yīng)用LSD法,方差不齊時應(yīng)用Tamhane法；統(tǒng)計水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果：(1)由平均化的T1加權(quán)像可觀察到：視覺刺激組、無刺激組及半刺激組均可呈現(xiàn)注射甘露醇破壞BBB的右側(cè)半球信號增強高于左側(cè)半球；靜脈給錳組未觀察到明顯的皮層信號增強,僅有微弱的雙側(cè)深部腦結(jié)構(gòu)增強；視覺刺激組的皮層信號增強主要位于右側(cè)視覺皮層；半刺激組的皮層信號增強位于右側(cè)視覺皮層及部分非視覺皮層,非視覺結(jié)構(gòu)信號增強并沒有集中在特異性的腦功能區(qū)；無刺激組的皮層信號增強則呈現(xiàn)廣泛化,沒有觀察到特異性的集中。(2)由像素基礎(chǔ)的圖像減影可以觀察到：視覺刺激組中與視覺刺激相關(guān)的主要信號增強區(qū)為視覺皮層；半刺激組中除了視覺皮層信號增強外,也有一些與視覺皮層無關(guān)的非特異性信號增強區(qū),這些非特異性增強區(qū)域沒有指向特定的功能區(qū)。(3)數(shù)據(jù)處理與分析：興趣區(qū)分析方差齊性檢驗顯示,三組視覺皮層標(biāo)準(zhǔn)化信號強度方差齊性(Levene statistic=2.151, P=0.151);單因素方差分析,三組視覺皮層標(biāo)準(zhǔn)化信號強度差異具有顯著性(F=15.539,P=0.000)；應(yīng)用LSD法兩兩比較顯示,任兩組比較差異均具有顯著性(tab=-2.594, abp=0.020; tac=-5.570, acp=0.000; tbc=-2.977, bcp=0.009),其中視覺刺激組及半刺激組的右側(cè)視覺皮層標(biāo)準(zhǔn)化信號強度高于無刺激組(abp=0.020；acp=0.000),視覺刺激組信號強度高于半刺激組(bcp=0.009)。右側(cè)視覺皮層錳含量分析支持了興趣區(qū)分析結(jié)果,方差齊性檢驗顯示三組視覺皮層錳含量方差不齊(Levene statistic=7.260, P=0.006),方差分析應(yīng)用Welch法檢驗顯示三組視覺皮層錳含量差異具有顯著性(Welch statistic=104.284,P=0.000),應(yīng)用Tamhane法兩兩比較顯示任兩組比較差異均具有顯著性(abp=0.040；acp=0.000；bcp=0.029),其中視覺刺激組及半刺激組的視覺皮層錳含量高于無刺激組(abp=0.000；acp=0.040),視覺刺激組視覺皮層錳含量高于半刺激組(bcp=0.029)。 結(jié)論及意義： 1本實驗條件下,應(yīng)用既往文獻所報道的1/6量Mn2+即可獲得更高強度的信號差異。 2開放BBB后, Mn2+大量入腦,進入不同區(qū)域的Mn2+可以在BBB關(guān)閉后持續(xù)進入激活區(qū)。 3以往認為開放BBB的作用是便于Mn2+透過開放的BBB直接進入受刺激皮層；本實驗提示BBB開放的另一作用是便于Mn2+透過開放的BBB進入腦內(nèi)非受刺激區(qū)或腦脊液,由此這些Mn2+可以在BBB關(guān)閉后仍能持續(xù)進入受刺激皮層。Mn2+這種通過BBB后的遷移過程將有利于減輕血管內(nèi)注藥而導(dǎo)致的血流動力學(xué)干擾。 4應(yīng)用ICP-MS補充證實了成像信號與錳濃度關(guān)系,在一定程度上彌補了信號強度與錳濃度非線性關(guān)系的不足。 第三部分：經(jīng)鼻腔給藥的錳離子增強視覺皮層磁共振功能成像 目的：探尋能夠繞過BBB而使錳離子發(fā)揮腦內(nèi)成像作用的方法。由于以上應(yīng)用的方法仍有部分不足(表現(xiàn)為BBB是Mn2+進入腦內(nèi)的最大障礙,頸動脈插管仍是有創(chuàng)操作,凝血問題不利于多次成像等),結(jié)合以往神經(jīng)傳導(dǎo)通路成像研究表明的“Mn2+可通過嗅覺通路進入嗅球,而嗅球是大鼠腦內(nèi)缺乏BBB區(qū)”這一結(jié)論,本實驗考慮通過鼻腔給藥,使錳首先通過神經(jīng)通路進入嗅球,再通過嗅球分布到腦功能激活區(qū),從而繞過BBB實現(xiàn)腦的功能成像。 方法：成年雄性Wistar大鼠(N=12只)分為兩組：完整嗅球組、嗅球切除組。實驗前,嗅球切除組切除雙側(cè)嗅球,完整嗅球組則不做切除處理。應(yīng)用2%異氟烷吸入麻醉后,進行MnCl2給藥,各組均由鼻腔插管注射MnCl2, MnCl2濃度為3mol/L,每側(cè)鼻腔注射5μ1。兩組同時進行視覺和嗅覺雙刺激,其中視覺刺激同第二部分方法,嗅覺刺激則采用Paulter法、以緩慢揮發(fā)的醋酸戊酯進行嗅覺刺激,持續(xù)進行20小時。獲取MEMRI圖像及后處理方法同第一部分研究,。數(shù)據(jù)資料統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS13.0軟件；計量資料的統(tǒng)計分析應(yīng)用t檢驗分析,統(tǒng)計水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果：(1)由平均化的T1加權(quán)像可觀察到：完整嗅球組嗅球的MRI信號明顯增強；而嗅球切除組,本應(yīng)嗅球?qū)?yīng)的腦功能區(qū)域無信號增強；視覺皮層冠狀面上,完整嗅球組也有視覺皮層MRI信號的增強,同時呈深部腦結(jié)構(gòu)MRI信號的輕微增強；而嗅球切除組同樣有深部腦結(jié)構(gòu)MRI信號的輕微增強,但卻沒有發(fā)現(xiàn)皮層MRI信號的增強。(2)由像素基礎(chǔ)的圖像減影可以觀察到：完整嗅球組中,與嗅球存在相關(guān)的主要增強區(qū)為視覺皮層。(3)數(shù)據(jù)處理與分析：興趣區(qū)分析中方差齊性檢驗顯示完整嗅球組與嗅球切除組視覺皮層信號強度方差齊性(F=3.199,P=0.104)；t檢驗顯示,完整嗅球組與嗅球切除組視覺皮層信號強度差異具有顯著性(t=3.973,P=0.003),完整嗅球組的視覺皮層信號強度高于嗅球切除組。視覺皮層錳含量分析亦支持興趣區(qū)分析的結(jié)果,方差齊性檢驗顯示完整嗅球組與嗅球切除組視覺皮層錳含量方差齊性(F=0.190,P=0.672)；t檢驗顯示完整嗅球組與嗅球切除組視覺皮層錳含量差異具有顯著性(t=-2.696,P=0.022),完整嗅球組視覺皮層錳含量高于嗅球切除組。 結(jié)論及意義： 1、鼻腔給藥可以無創(chuàng)性地繞過BBB進行視覺皮層功能成像； 2、嗅覺刺激對MEMRI成像的信號增強起有重要的正性調(diào)控作用。 第四部分：重復(fù)經(jīng)顱磁刺激錳離子增強磁共振功能成像 目的：進一步驗證動脈給藥MEMRI成像方法。第二部分實驗證實,在激活視覺皮層的情況下,通過開放BBB并延長刺激時間的方法,可以應(yīng)用低劑量MnCl2獲得更高的目標(biāo)皮層信號強度改變。因第二部分實驗方法獲得的功能皮層磁共振錳增強信號較第三部分實驗即經(jīng)鼻腔給藥的MEMRI方法更明顯,所以適合于NSCs移植后微弱的功能測定,為進一步驗證該方法也適用于其他腦區(qū)激活的情況,進行了本實驗,即通過重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magneticstimulation, rTMS)全腦激活,應(yīng)用MEMRI觀察其他腦區(qū)的激活情況,同時也為rTMS提供新的影像學(xué)研究方法。 方法：成年雄性Wistar大鼠(N=18只)均分為三組：高頻磁刺激組、低頻磁刺激組、假刺激組。首先應(yīng)用36mg/ml水合氯醛按360mg/kg腹腔注射麻醉,麻醉生效后、進行右側(cè)頸外動脈插管用于注射藥物。各組均在進行30%甘露醇右側(cè)頸外動脈注射(7mg/kg)、開放BBB后給予MnCl2 (5mg/kg),之后放于固定裝置中行rTMS,高頻刺激頻率設(shè)置為10Hz、250次持續(xù)刺激、每次持續(xù)刺激時間1s、間隔時間79s,刺激結(jié)束時共接受2250個刺激脈沖,低頻設(shè)置為1Hz、750次持續(xù)刺激、每次持續(xù)刺激時間3s、間隔時間21s,刺激結(jié)束時共接受2250個刺激脈沖。假刺激組大鼠同樣放置于固定裝置中5小時,但將線圈與顱骨成90。角放置,從而使磁場遠離鼠腦、僅提供與高頻或磁刺激同樣的磁場噪音。磁共振數(shù)據(jù)的獲取在給錳和磁刺激5小時后進行。獲取MEMRI圖像及后處理同第一部分研究。數(shù)據(jù)資料統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS13.0軟件；計量資料的統(tǒng)計分析應(yīng)用單因素方差分析,組間兩兩比較應(yīng)用LSD法；統(tǒng)計水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果：(1)由平均化的T1加權(quán)像可觀察到：假刺激組、高頻磁刺激組及低頻磁刺激組,在注射甘露醇破壞BBB的右側(cè)半球,信號增強均高于左側(cè)半球；高頻磁刺激組,全腦冠狀層面的右側(cè)皮層均有信號增強；低頻磁刺激組的皮層信號增強,分布在包含運動感覺皮層的冠狀層面右側(cè)；假刺激組則未出現(xiàn)特異性皮層信號增強情況。(2)由像素基礎(chǔ)的圖像減影可以觀察到：高頻磁刺激組中,與磁刺激相關(guān)的主要信號增強區(qū)為嗅球、包含運動感覺視覺區(qū)的冠狀層面右側(cè)皮層、右側(cè)下丘；低頻刺激組中,與磁刺激相關(guān)的主要增強區(qū)為包含運動感覺區(qū)的冠狀層面右側(cè)皮層及右側(cè)下丘。(3)數(shù)據(jù)處理與分析：興趣區(qū)分析中,方差齊性檢驗顯示,三組右側(cè)運動皮層標(biāo)準(zhǔn)化信號強度方差齊性(Levene statistic =1.733, P=0.210);單因素方差分析,三組右側(cè)運動皮層標(biāo)準(zhǔn)化信號強度差異具有顯著性(F=28.533,P=0.000)；應(yīng)用LSD法兩兩比較顯示,任兩組右側(cè)運動皮層標(biāo)準(zhǔn)化信號強度比較差異均具有顯著性(tab=-7.505, abp=0.000; tac=-4.500, acp=0.000; tbc=3.006, bcp=0.009),其中高頻磁刺激組及低頻磁刺激組右側(cè)運動皮層標(biāo)準(zhǔn)化信號強度高于假刺激組(abp=0.000；acp=0.000),高頻磁刺激組信號強度高于低頻磁刺激組(bcp=0.009)。運動皮層錳含量分析也支持了這些有關(guān)興趣區(qū)的分析結(jié)果,方差齊性檢驗顯示,三組運動皮層錳含量方差齊性(Levene statistic=3.575, P=0.054);單因素方差分析三組運動皮層錳含量,差異具有顯著性(F=44.680,P=0.000)；應(yīng)用LSD法兩兩比較顯示,任兩組比較運動皮層錳含量差異均具有顯著性(tab=-9.295,abp=0.000；tac=3.156,acp=0.007；tbc=6.139,bcp=0.000),其中高頻刺激組及低頻刺激組運動皮層錳含量高于假刺激組(abp=0.000；acp=0.007),高頻刺激組運動皮層錳含量高于低頻刺激組(bcp=0.000) 結(jié)論及意義： 1、MEMRI功能成像方法不僅適用于視覺皮層功能成像,也可以應(yīng)用于rTMS研究； 2、本實驗提供了一個可用于rTMS治療及機制研究的新rTMS動物模型； 3、佐證高頻磁刺激可提高局部腦活性、而低頻降低腦活性。 4、高頻刺激可以獲得更廣泛的激活區(qū)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R445.2
【圖文】：

圖2.2右側(cè)頸外動脈插管手術(shù)示意圖。藍色箭頭為PE50導(dǎo)管插入方向及注藥方向紅色箭頭為血流方向。Figure2.2Sehematiediagramoftherightextemalearotidarterysurgery.BluearrowindicatedthedirectionofthePE50tubeinjeetionandthedrugadministrationredarrowindieatedthedireetionofbloodflow.

右側(cè)頸外動脈插管手術(shù)截圖

【參考文獻】

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本文編號：2726821