【摘要】：背景與目的:由于膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長,術(shù)后放射治療已成為膠質(zhì)瘤治療的重要輔助手段之一。但因膠質(zhì)瘤的放射抵抗性,其放療效果不甚理想。CFL1在腫瘤的遷移和侵襲中有重要作用。本課題旨在探討CFL1與膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞放射抵抗之間的關(guān)系及CFL1介導(dǎo)的U251細(xì)胞放射抵抗可能的機(jī)制,為提高膠質(zhì)瘤對放射治療的敏感性提供新的解決途徑。方法:建立RR-U251細(xì)胞、質(zhì)粒誘導(dǎo)過表達(dá)CFL1的U251細(xì)胞和RR-U251細(xì)胞、CFL1-siRNA敲除CFL1的U251細(xì)胞和RR-U251細(xì)胞。對不同方法處理的U251細(xì)胞和RR-U251細(xì)胞進(jìn)行放射治療,采用MTT法測定細(xì)胞的相對存活率,劃痕實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞的遷移能力,Transwell小室法測定細(xì)胞的侵襲能力,流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期。Western Blot及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)觀察CFL1表達(dá),進(jìn)而觀察細(xì)胞的放射敏感性變化。建立裸鼠人膠質(zhì)瘤移植模型,通過運(yùn)用活體電穿孔和瘤內(nèi)注射轉(zhuǎn)染技術(shù),將CFL1-siRNA轉(zhuǎn)染入移植瘤內(nèi),采用Western blot及免疫組化法分析瘤內(nèi)CFL1的表達(dá)情況。對不同治療組進(jìn)行放射治療,觀察瘤體生長情況,繪制生長曲線,進(jìn)一步探討CFL1在體內(nèi)與膠質(zhì)瘤放射抵抗的關(guān)系。應(yīng)用 Y-27632 阻斷 RhoA-ROCKⅡ-LIMKⅡ 途徑;應(yīng)用 CK-666 阻斷Cdc42-NWASP-Arp2/3 及 Cdc42-MRCKα-Arp2/3 途徑;應(yīng)用 PAK1-shRNA,阻斷 Rac-PAK-LIMKⅡ 及 Cdc42-PAK-LIMKⅡ 途徑;應(yīng)用 MRCKα-shRNA 阻斷Cdc42-MRCKα-LIMKⅡ 及 Cdc42-MRCKα-Arp2/3 途徑;放射治療后,應(yīng)用Western Blot分析CFL1表達(dá)變化,MTT法分析細(xì)胞活力,劃痕實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移能力,Transwell小室法分析細(xì)胞侵襲能力,研究CFL1介導(dǎo)的U251細(xì)胞放射抵抗機(jī)制。結(jié)果:RR-U251細(xì)胞中CFL1的表達(dá)量增高,與正常U251細(xì)胞比較具有顯著差異(p0.001);RR-U251細(xì)胞的相對生存率、遷移能力及侵襲能力均上升,與正常U251細(xì)胞相比具有顯著差異(p0.05);放射治療后RR-U251細(xì)胞阻滯于G2/M期的細(xì)胞較U251細(xì)胞減少,放射敏感性降低。當(dāng)抑制U251細(xì)胞、RR-U251細(xì)胞和CFL1過表達(dá)的U251細(xì)胞中CFL1表達(dá)時(shí),細(xì)胞的相對生存率降低、侵襲能力減弱,阻滯于G2/M期的細(xì)胞增多,細(xì)胞凋亡增多,放射敏感性增加,與對照組比較具有顯著差異(p0.05);CFL1過表達(dá)的U251細(xì)胞的相對存活率、遷移能力以及侵襲能力均上升,阻滯于G2/M期的細(xì)胞減少,與正常U251細(xì)胞相比具有顯著性差異(p0.05),放射敏感性降低。Western Blot及免疫組化結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染CFL1-siRNA的移植瘤內(nèi)CFL1表達(dá)下降。瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染CFL1-siRNA聯(lián)合放射治療,腫瘤生長受到明顯抑制。應(yīng)用ROCK抑制劑Y-27632或Arp2/3抑制劑CK-666,CFL1表達(dá)下降,RR-U251細(xì)胞的相對生存率、遷移能力、侵襲能力下降,與對照組比較具有顯著差異(p0.05),放射敏感性增加;抑制PAK1或MRCKα表達(dá),CFL1表達(dá)無明顯變化,RR-U251細(xì)胞的相對生存率、遷移能力、侵襲能力下降,與對照組比較具有顯著差異(p0.05),放射敏感性增加。結(jié)論:降低U251細(xì)胞中CFL1的表達(dá),可以提高膠質(zhì)瘤的放射敏感性;調(diào)節(jié)RhoA-ROCKⅡ-LIMKⅡ,Cdc42-NWASP-Arp2/3 及 Cdc42-MRCKα-Arp2/3 途徑中ROCK和Arp2/3,對膠質(zhì)瘤放射敏感性產(chǎn)生影響,并與CFL1有關(guān);調(diào)節(jié)Rac-PAK-LIMKⅡ 及 Cdc42-PAK-LIMKⅡ 通路中 PAK1,調(diào)節(jié) Cdc42-MRCKα-LIMKⅡ及Cdc42-MRCKα-Arp2/3通路中MRCKα對膠質(zhì)瘤放射敏感性產(chǎn)生影響,但可能與CFL1無關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R730.55;R739.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2683073