【摘要】：第一部分 胰腺癌Survivin基因的MR分子探針的構(gòu)建 目的：合成殼聚糖修飾的磁性納米顆粒以及靶向胰腺癌Survivin基因的MR分子探針。并對該納米顆粒和MR分子探針的性質(zhì)進行表征。 材料與方法：1、共沉淀法制備γ-Fe2O3納米顆粒：在N2的保護下將氨水逐漸滴入200mL PH值1.7的FeC13·6H2O (0.01M)和FeSO4·7H2O (0.006M)的混合溶液中,同時劇烈的攪拌溶液,直到混合液的PH值上升到9時,得到黑色的沉淀物。使用磁分離法洗滌4-5次即得到Fe304納米顆粒。用0.1M的HCl調(diào)節(jié)溶液PH值至3.0,在95-100℃鼓入空氣,攪拌1h左右直至溶液變成棕紅色即得到γ-Fe203。其次使用殼聚糖(Chitosan, CS)對γ-Fe2O3納米顆粒表面進行修飾(修飾后的納米顆粒表示為CS@MNPs):將0.03g殼聚糖粉末溶解于3m11%的醋酸溶液中,加入到20mL、3.8mg/mL的γ-Fe2O3溶液中,室溫充分?jǐn)嚢?h后磁分離法水洗3-4次,洗去游離的CS,最終將得到的納米顆粒CS@MNPs分散在水中,超聲充分分散后用0.1M的HCl調(diào)節(jié)PH值至5,溶液于4℃保存?zhèn)溆谩?2、MR分子靶向探針的制備：(1)將3.5光密度值(Optical density,OD) Survivin反義寡聚脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN)在偶聯(lián)劑EDC/NHS (1-ethyl-3-(3-dimethyl-amino-propyl)-1-carbo-DiImidehydrochloride/N-hydroxysuc-cinimide)溶液中25℃活化20min,然后以加入不同劑量CS@MNPs繼續(xù)以25℃震蕩2h�；旌弦河么欧蛛x法洗滌2-3次,將所制得的探針Sur-MNPs (Survivinmagnetic molecular probe,Sur-MNPs)分散于水溶液中,調(diào)節(jié)PH值至5.0。(2)采用瓊脂糖凝膠電泳分析靶向探針的偶聯(lián)效果；采用透射電鏡(Transmission electron microscopy,TEM)觀察CS@MNPs和探針的形態(tài)及核心粒徑；通過傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)分析CS@MNPs的表面基團。使用振動樣品磁強計(Vibrating sample magnetometer, VSM)、磁共振等測量CS@MNPs和探針的磁學(xué)性質(zhì)。 結(jié)果：反義寡聚核苷酸成功地被連接到CS@MNPs表面得到靶向胰腺癌Survivin基因的靶向探針。CS@MNPs的紅外光譜圖上出現(xiàn)了殼聚糖的氨基峰說明了殼聚糖已經(jīng)包被到了γ-Fe2O3的表面。透射電鏡結(jié)果顯示靶向探針納米顆粒的核心粒徑在12nnm左右,分散均勻。CS@MNPs的弛豫率為68.25mM-1×S-1接近文獻記載的磁性樣品的值,適合作為MR成像的對比劑。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示MR探針?biāo)谟镜莱霈F(xiàn)了位置與單純Survivin ASODN一樣的條帶,說明了納米顆粒表面連接了ASODN。通過化學(xué)交聯(lián)法制備出的MR探針具有穩(wěn)定性和分散性好、顆粒均勻、磁學(xué)性質(zhì)良好的優(yōu)點。 結(jié)論：本實驗中研制出的MR分子靶向探針Sur-MNPs粒徑小、磁學(xué)參數(shù)理想,具備了作為MR對比劑的條件,為進一步的分子探針的體內(nèi)外實驗奠定了基礎(chǔ)。 第二部分 Survivin基因MR分子探針體外轉(zhuǎn)染胰腺癌BxPC-3細(xì)胞系 目的：通過CS@MNPs、Sut-MNPs與胰腺癌細(xì)胞共同孵育的方法評價探針對癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果以及分析修飾后的顆粒CS@MNPs的細(xì)胞毒性。研究分析制備的靶向探針體外成像的能力 材料與方法：將γ-Fe2O3、CS@MNPs、Sur-MNPs三種不同的納米顆粒分別與胰腺癌細(xì)胞BxPC-3共同孵育24h后,(1)通過普魯士藍(lán)染色定性觀察細(xì)胞對這三種納米顆粒的吞噬情況；(2)采用二甲基四氮唑法(Microculture tetrazolium assay, MTT)測CS@MMNPs、γ-Fe2O3對細(xì)胞活力的影響,設(shè)置人肺成纖維細(xì)胞WI-38細(xì)胞作為對照組；(3)通過透射電鏡(TEM)分析納米顆粒在細(xì)胞的分布：將孵育后的三組細(xì)胞(調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)約lxl05個)加入1ml濃鹽酸水浴60℃裂解細(xì)胞使細(xì)胞內(nèi)的鐵納米顆粒充分溶解為鐵離子,然后用鄰二氮菲法測定鐵濃度,計算單個細(xì)胞吞噬的鐵含量。另收集細(xì)胞懸液,用2.5%戊二醛溶液40℃固定1h,室溫下1%四氧化鋨溶液固定1h, PBS清洗2-3次,每次5min,梯度乙醇脫水,環(huán)氧樹脂包埋,常規(guī)制作超薄切片,轉(zhuǎn)移到銅網(wǎng),透鏡觀察顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。(4)分別收集三組標(biāo)記的細(xì)胞,用1ml1%瓊脂糖溶液將細(xì)胞重懸于Eppendorf管中,輕微吹打分散細(xì)胞,待瓊脂糖冷卻凝固后,置于1.5T MR上行橫斷位掃描,另設(shè)純凈水、未孵育任何納米材料的空白細(xì)胞作為對照組。MR掃描參數(shù)為：T2WI SE序列重復(fù)時間(Revetition time, TR):2500ms,回波時間(Time of echo,TE):22ms,16個回波,翻轉(zhuǎn)角30。,視野250mm,層厚5mm,矩陣256×128。勾畫感興趣區(qū)(ROI)0.32cm2,分別測定各管T2值。 結(jié)果：普魯士藍(lán)染色顯示孵育CS@MNPs和MR探針的胰腺癌細(xì)胞內(nèi)有大量的藍(lán)色鐵顆粒分布,而孵育γ-Fe2O3的癌細(xì)胞組內(nèi)僅散在少許細(xì)胞內(nèi)見到藍(lán)色顆粒,說明靶向探針和修飾后的納米顆粒能夠有效的轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞。MTT結(jié)果可見修飾后的納米顆粒CS@MNPs對細(xì)胞的毒性明顯低于未經(jīng)修飾的γ-Fe2O3組。TEM結(jié)果顯示納米顆粒分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),幾乎未能進入細(xì)胞核。各組鐵含量中探針組最高18.24±0.79pg;γ-Fe2O3組最低9.32±0.21pg。磁共振結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染磁性納米后的細(xì)胞能降低T2WI的信號,其中以轉(zhuǎn)染靶向探針的細(xì)胞組最為明顯,各組T2值分別為：空白細(xì)胞組331.5±18.3ms,γ-Fe2O3組219.5±21.8ms, CS@MNPs組218.0士17.3ms,探針組171.7±32.5ms。 結(jié)論：經(jīng)殼聚糖修飾后的納米顆粒能夠有效降低細(xì)胞毒性作用,顯著提高了轉(zhuǎn)染效率,因此選用其作為MR分子探針的載體能高效的轉(zhuǎn)染胰腺癌BXPC-3細(xì)胞,并能在較低濃度引起MR T2WI信號的下降。透射電鏡結(jié)果顯示本實驗制備的探針是能夠穿過細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)。因此,本實驗制備的探針Sur-MNPs是一個良好的特異性靶向胰腺癌的MR分子探針。 第三部分 MR靶向探針應(yīng)用于裸鼠胰腺癌模型的活體MR成像研究目的：1、建立原位人胰腺癌裸鼠模型；2、研究靶向探針Sur-MNPs對胰腺癌裸鼠模型的MR分子成像,結(jié)合MR圖像和病理結(jié)果分析靶向探針的MR成像效果及體內(nèi)分布情況。 材料與方法：1、培養(yǎng)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株(BxPC-3-GFP)待細(xì)胞貼壁生長狀態(tài)良好時,胰酶消化、離心,將細(xì)胞懸液分別注射于15只裸鼠的腹部皮下。待皮下腫瘤成形后取部分腫瘤組織,手術(shù)縫合至裸鼠胰腺內(nèi),于熒光成像儀下動態(tài)監(jiān)測腫瘤生長情況,待腫瘤生長到lcm左右時行MR分子成像實驗。2、MR掃描參數(shù)：常規(guī)T1WI:TR650ms, TE29ms,層厚1mm,層距為0.1mm; T2WI冠狀位及軸位：TR/TE為7400ms/71ms;層厚1mm,層距為0.1mm；T2WI快速自旋回波序列(Fast spin echo,FSE):TR/TE為1850ms/14.9ms,激勵次數(shù)12；層厚lmm,層距為O.1mm。先對荷瘤鼠行MR平掃,再經(jīng)尾靜脈注入200u1的0.5mg/ml靶向探針,分別在注射探針后30min、12h、24h、40h各時間點做MR增強掃描,于各時間點分別處死3只裸鼠。對照組設(shè)3只裸鼠注射非靶向探針CS@MNPs。掃描結(jié)束后,取小鼠的肝、脾、腎、胰腺、腫瘤組織進行HE、普魯士藍(lán)染色等病理檢測。3、對比MRI圖像和組織的普魯士藍(lán)染色結(jié)果,評價胰腺癌靶向探針的靶向成像效果。對所得圖像腫瘤部位畫出感興趣區(qū)(Read of interest,ROI)測量T2值,采用單因素方差分析(One-factor analysis of variance, ANOVA)于SPSS18.0統(tǒng)計軟件上比較分析平掃、增強后24h、40h之間的信號差異,p0.05認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：注射探針24h后普魯士藍(lán)染色顯示腫瘤組織周邊有較多的藍(lán)色鐵顆粒分布,MR T2WI上可見腫瘤組織信號的有著輕度的降低(T2值70.4±7.4ms,平掃為84.3±6.1ms)；42h時腫瘤的中心部位開始見到藍(lán)色的鐵顆粒(T2值56.9±2.3ms),說明靶向探針能夠穿越肝脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬到達(dá)腫瘤組織T2WI信號有著輕度的降低,但組織的病理普魯士藍(lán)染色顯示靶向探針已經(jīng)較多的分布在腫瘤組織內(nèi)。統(tǒng)計學(xué)分析F=20.812,p=0.000,24h與40h之間的信號差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.003) 結(jié)論：MR分子探針能有效的分布到裸鼠的胰腺原位腫瘤,引起瘤體MRT2信號的降低,其普魯士藍(lán)染色結(jié)果也證實該探針能分布在胰腺癌組織中,表明Sur-MNPs是一個理想的胰腺癌MR靶向分子探針,但是應(yīng)用于臨床仍需要解決如何放大信號等問題。
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2.3. 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞m跬鍪笛橥，

本文編號：2670563