【摘要】：研究背景: 血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)主要是由血管內(nèi)皮細胞、基底膜、星形膠質(zhì)細胞終足構成的一道擴散屏障,幾乎存在于整個腦組織。腦毛細血管內(nèi)皮細胞與身體其他部位內(nèi)皮細胞不同,細胞之間沒有孔隙,取而代之的是細胞間的緊密連接(tight junction,TJ)。腦毛細血管內(nèi)皮細胞缺乏囊泡胞飲系統(tǒng)[1],但含有豐富的酶系統(tǒng),可以分解各種藥物及營養(yǎng)物質(zhì),構成了一道酶屏障[2]。正是由于腦內(nèi)毛細血管內(nèi)皮細胞這些特殊結構使得BBB能在保護腦組織不受外界傷害性刺激影響的同時也將許多治療性藥物拒之門外[3]。因此近幾年開發(fā)了很多增加BBB通透性的方法來幫助藥物、抗體、基因成功地透過BBB進入腦組織。有體外實驗研究證實超聲能夠用來打開血-組織屏障,使大分子和基因能夠穿過細胞質(zhì)膜[4]。此外高強度聚焦超聲也可以用于選擇性的開放大鼠BBB。在超聲照射前給予一定量微泡造影劑,因為超聲空化核的引入可以降低超聲開放BBB時所需要的超聲能量,從而可以減少組織損害的風險并使該技術能夠通過完整的顱骨實施BBB能夠可逆性的開放BBB而不引起神經(jīng)細胞的急性損傷。而目前尚無診斷超聲聯(lián)合超聲造影劑SonoVue開放血腦屏障的報道。因此本實驗就將就這一空白進行研究,并進一步探討SonoVue介導UC開放BBB的安全性。 目的 首先驗證超聲造影劑聲諾維(SonoVue)介導診斷超聲(diagnostic ultrasound,DU)增加大鼠BBB通透性的可行性與可逆性,同時進行動脈血氣分析檢測該方法是否會對大鼠循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。隨后使用組織學染色來觀察本實驗條件的超聲造影(ultrasonic contrast,UC)是否會造成大鼠神經(jīng)細胞的壞死及紅細胞的滲出。最后通過Morris水迷宮實驗(Morris water maze, MWM)來檢測大鼠學習記憶功能進一步評估本實驗開放BBB方法的安全性。 方法 實驗一、SonoVue介導DU開放大鼠BBB可行性和可逆性研究以及對大鼠動脈血氣的影響 1.SonoVue介導DU開放大鼠BBB可行性 根據(jù)處理方法的不同將32只大鼠隨即分為四組,每組8只:Con組大鼠僅進行麻醉、備皮、靜脈置管,而不進行其他操作直接給予伊文思藍(Evens blue,EB);單純超聲組動物進行麻醉、備皮、靜脈置管后給予生理鹽水,然后進行超聲10min,并同時注射EB;單純造影劑組大鼠在麻醉、備皮、靜脈置管后直接給予SonoVue,10min后靜脈注射EB;UC組大鼠在進行麻醉、備皮、靜脈置管后,靜脈注射SonoVue同時開始UC10min,超聲結束即刻給予EB。 2.SonoVue介導DU開放大鼠BBB的可逆性 為確定BBB開放是否可逆,根據(jù)時間不同又將實驗動物隨機分為4組:2h、4h、6h、8h組,分別于UC后的2h、4h、6h、8h注射EB檢測當時BBB開放情況,每組SD大鼠8只。 3.SonoVue介導DU開放BBB對大鼠動脈血氣的影響 隨機抽取8只進行UC的大鼠,每只大鼠分別于UC前、UC5min、UC后即刻抽取動脈血1ml檢測其動脈血PO2、PCO2、PH等指標。 實驗二SonoVue介導DU開放BBB對大鼠腦組織神經(jīng)細胞的影響 三只雄性SD大鼠經(jīng)UC開放BBB后取腦切片進行HE染色,在顯微鏡下觀察神經(jīng)細胞是否有壞死及是否有紅細胞滲出。 實驗三SonoVue介導DU開放BBB對大鼠學習記憶功能的影響 實驗動物隨機分為三組,每組8只大鼠:Con組,該組大鼠不做任何處理直接進行MMW;假手術組,該組大鼠僅進行麻醉、備皮、靜脈置管,而不給予UC,并于麻醉后24h開始進行MWM實驗;UC組:該組大鼠進行麻醉、備皮、靜脈置管、給予UC,并于超聲后24h開始進行MWM實驗。 結果 1. SonoVue可以介導DU局灶性的開放大鼠BBB,主要表現(xiàn)在超聲輻照區(qū)局部EB滲出;且這一通透性的改變是可逆的,BBB的開放可以持續(xù)4h。 2.大劑量SonoVue不會影響大鼠動脈血氣的變化。 3.本實驗參數(shù)不會對超聲輻照區(qū)域大鼠神經(jīng)細胞產(chǎn)生損害,不會造成腦血管內(nèi)皮細胞損害使紅細胞滲出。 4.通過對大鼠進行MWM實驗可觀察到UC開放BBB后的大鼠在定位航行實驗中與Con組和Sham組相比逃逸潛伏期縮短,上臺前距離縮短;在最后一天空間探索實驗中的目標象限停留時間延長。證明UC開放BBB后的大鼠其空間學習與記憶能力都有所提高。 結論 本實驗首先通過EB滲透法證明超聲造影劑聲諾維介導診斷超聲可以局部開放大鼠BBB,且BBB通透性的增加可以持續(xù)4h。同時使用腦組織HE染色來觀察超聲造影不會造成大鼠神經(jīng)細胞的壞死也不會造成超聲照射區(qū)紅細胞的滲出。MWM實驗證明大鼠在超聲造影后空間學習記憶功能都有所提高。因此我們可以得出本實驗所使用的UC參數(shù)可以靶向性、可逆性開放BBB且不會對CNS結構和功能以及大鼠動脈血氣造成不良影響。
【圖文】：

圖 1 、BBB 的超微結構常生理功能的發(fā)展，人們對BBB的認識的不斷加深，BBB已經(jīng)包面的含義了：1.保護腦組織不受血液中有害物質(zhì)的損2.保護腦組織不受身體其他部位的激素或神經(jīng)傳導物是被動保護性屏障，還能選擇性地將腦內(nèi)有害或過剩的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。4.BBB還具有體液調(diào)節(jié)功能并遵循Sta水壓力下進人腦組織的水分，都將由被BBB阻滯于毛漿蛋白形成的滲透壓所建立起的一種反向力量將其重有效地控制水分及其溶質(zhì)進入腦組織[10]。在病理情況素影響下，BBB容易遭到破壞這種調(diào)控作用消失，表中的成分包括電解質(zhì)和血漿蛋白被血液壓力經(jīng)開放的

圖 2、Con 組與 UC 開放 BBB 組大鼠腦 EB 的滲出3.3 大腦中 EB 含量如表 3 所示，與對照組相比，，單純超聲組和單純給予 SonoVue 組大鼠腦內(nèi) EB 含量無統(tǒng)計學差異。而給予 UC 后即刻組 EB 滲出最多，2h 組和 4h組 EB 含量有所下降但仍能檢測到。而 6h 組和 8h 組 EB 含量與對照組相比已無統(tǒng)計學差異。表 3 大鼠腦中 EB 含量（n= 8 ， ±s）EB 吸光度值 腦重 g EB 含量 μg/gcon 0.0352±0.00606 1.3705±0.12534 0.4138±0.10104DU 0.0378±0.00976 1.4149±0.12987 0.4392±0.15468SonoVue 0.0395±0.00843 1.4118±0.11342 0.4563±0.100720h 0.2970±0.08894 1.3968±0.09015 4.1841±1.22986*
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R445.1

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本文編號：2658526