發(fā)布時間：2020-04-09 17:30

【摘要】：研究背景： 糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是終末期腎臟疾病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因，與ESRD較高的死亡率密切相關(guān)。目前廣泛認(rèn)為小管間質(zhì)損害是ESRD可靠的預(yù)測因子并與腎功能障礙密切相關(guān)。微量白蛋白尿是糖尿病腎病的早期征象�，F(xiàn)有許多證據(jù)表明對糖尿病腎病進(jìn)行早期干預(yù)和精確調(diào)控可以減緩，甚至逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病的進(jìn)程。因此，對早期糖尿病腎病進(jìn)行及早干預(yù)、提高治療物質(zhì)在腎間質(zhì)的聚集是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題。目前治療糖尿病腎病的常用方法諸如調(diào)控血糖、胰腺和腎臟移植、透析治療等雖然能改善腎功能，卻因當(dāng)前藥物治療和治療技術(shù)的有限性，導(dǎo)致并發(fā)癥多、生存質(zhì)量不高，效果并不顯著。 骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)移植治療是近年來國內(nèi)外研究的重點(diǎn)，其易于分離提取，具有高度的擴(kuò)增潛能，有良好的基因穩(wěn)定性、組織相容性好、不涉及倫理道德問題，為受損組織和器官的修復(fù)開辟了一條新途徑。MSCs能夠分化為功能性的胰島素生成細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)糖尿病大鼠高血糖狀態(tài)，也能夠分化為腎臟細(xì)胞修復(fù)受損腎臟。因而，MSCs移植治療被認(rèn)為是改善高血糖和腎功能的、具有極大吸引力的治療手段。但骨髓中MSCs含量極少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于腎臟修復(fù)所需要細(xì)胞的量，加上目前干細(xì)胞移植治療移植后細(xì)胞存活率較低、干細(xì)胞靶向歸巢能力欠佳等問題，均極大地限制了其應(yīng)用。因此，如何調(diào)控骨髓干細(xì)胞的腎向性、提高干細(xì)胞靶向歸巢能力和移植的有效性是干細(xì)胞移植治療腎臟疾病的關(guān)鍵。 超聲介導(dǎo)的微泡破壞(Ultrasound-mediated microbubble destruction)作為一種新的、極具前景的治療方法應(yīng)用于多個領(lǐng)域，例如將藥物和基因傳遞到心血管系統(tǒng)，開放血腦屏障和血瘤屏障，增強(qiáng)毛細(xì)血管和血管通透性以及促進(jìn)干細(xì)胞歸巢等。腎臟是高濾過器官，對生物學(xué)效應(yīng)較為敏感，對于腎臟疾病的干細(xì)胞移植治療，超聲介導(dǎo)的微泡破壞作用是否同樣有效呢？研究顯示，超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀(1.0W/cm~2)聯(lián)合自制微泡能有效促進(jìn)MSCs歸巢至腎臟，使急性腎損傷大鼠腎功能得到明顯改善。該研究還發(fā)現(xiàn)，超聲+微泡組大鼠腎臟ICAM-1mRNA表達(dá)高于對照組、超聲+微泡+MSCs組大鼠腎臟ICAM-1mRNA表達(dá)高于單純MSCs移植組，說明超聲介導(dǎo)的微泡破壞可以增加MSCs的靶向黏附、提高M(jìn)SCs歸巢至腎臟的能力，進(jìn)而更有效地實(shí)現(xiàn)MSCs靶向移植治療腎臟疾病的效果。 然而，關(guān)于慢性腎臟疾病的干細(xì)胞治療，超聲介導(dǎo)的微泡破壞作用對其影響的研究較少，本實(shí)驗嘗試?yán)贸暯閷?dǎo)的微泡靶向破壞作用，經(jīng)靜脈移植MSCs治療鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病腎病大鼠，并試圖探索其安全性及可能機(jī)制，期望能提供一種新的、非侵入性的方法，對糖尿病腎病患者給予系統(tǒng)性藥物治療的前提下選擇性增強(qiáng)干細(xì)胞在腎臟的聚集，最大化提高糖尿病腎病的治療效果，為提高干細(xì)胞無創(chuàng)、有效地靶向歸巢及減緩疾病進(jìn)程、或是逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病病程進(jìn)展提供一種新思路和新方法。 研究目的： 1.探討診斷超聲介導(dǎo)的微泡破壞促進(jìn)經(jīng)靜脈移植的同源異體MSCs歸巢糖尿病腎病大鼠腎臟的可行性和安全性； 2.探討在診斷超聲介導(dǎo)的微泡破壞作用下，經(jīng)靜脈移植的MSCs對修復(fù)大鼠糖尿病腎病的有效性； 3.初步探討診斷超聲介導(dǎo)的微泡破壞技術(shù)對促進(jìn)靜脈移植的MSCs靶向歸巢并修復(fù)大鼠糖尿病腎病的可能機(jī)制。 研究方法： 1.采用全骨髓培養(yǎng)法對SD (Sprague Dawley)大鼠骨髓MSCs進(jìn)行分離、培養(yǎng)、及純化，檢測其生物學(xué)特性。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記分子，成脂、成骨誘導(dǎo)分化進(jìn)行細(xì)胞鑒定。為便于對體內(nèi)干細(xì)胞的追蹤，采用攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的慢病毒對培養(yǎng)的MSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并觀察轉(zhuǎn)染后MSCs表達(dá)綠色熒光情況及細(xì)胞毒性反應(yīng)。 2.腹腔單次注射60mg/Kg SZT建立穩(wěn)定的大鼠1型早期糖尿病腎病模型，隨機(jī)血糖濃度和尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate, UAER)評價模型是否成功建立。 3.①觀察eGFP標(biāo)記的MSCs歸巢腎臟的情況。模型大鼠被隨機(jī)分為MSCs組和超聲+微泡+MSCs組，兩組均經(jīng)尾靜脈移植MSCs，72h后采用激光共聚焦顯微鏡觀察eGFP標(biāo)記的MSCs在腎臟的定植情況，觀察MSCs在MSCs組與超聲+微泡+MSCs組腎臟內(nèi)的熒光分布并進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)和統(tǒng)計學(xué)比較。②超聲介導(dǎo)的微泡破壞對糖尿病腎病模型大鼠腎臟通透性的影響。模型大鼠被隨機(jī)分為三個批次，每一批次均分為對照組(未處理組)、超聲組、微泡組與超聲+微泡組。第一批次大鼠在注射伊文思藍(lán)(evans blue, EB)同時接受相應(yīng)處理，1小時后檢測EB含量、激光共聚焦顯微鏡及透射電鏡觀察各組毛細(xì)血管通透性改變，實(shí)時熒光定量PCR (Real-Time PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測E選擇素(E-selectin)的mRNA和蛋白表達(dá)，腎臟組織學(xué)觀察超聲介導(dǎo)的微泡破壞對組織結(jié)構(gòu)的可能損害；第二批次大鼠(處理同第一批次)24小時后檢測UAER評價超聲介導(dǎo)的微泡破壞對腎臟濾過功能可能的影響；第三批次大鼠(恢復(fù)組)接受相應(yīng)處理后24小時再接受EB注射，觀察毛細(xì)血管通透性的恢復(fù)。 4.模型大鼠被隨機(jī)分為正常非糖尿病腎病組、未治療組、超聲+微泡組、MSCs組與超聲+微泡+MSCs組。給予相應(yīng)處理后1、2、4、8周每周固定時間點(diǎn)檢測各組隨機(jī)血糖濃度。8周后，檢測大鼠UAER和血漿胰島素水平、透射電鏡觀察腎小球和腎小管超微結(jié)構(gòu)、腎臟PAS染色和胰腺HE染色觀察腎臟和胰腺病理結(jié)構(gòu)，胰腺組織免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)觀察胰島β細(xì)胞和α細(xì)胞分布及數(shù)量恢復(fù)，酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)檢測抗炎因子白細(xì)胞介素10(IL-10)的蛋白表達(dá)，免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry, IHC)檢測促纖維化因子TGF-β1在腎內(nèi)的分布和表達(dá)，并進(jìn)行半定量分析。 結(jié)果： 1.培養(yǎng)的MSCs貼壁生長，形態(tài)以梭形為主；細(xì)胞表面高表達(dá)CD44(99.44%)和CD90(99.37%)，幾乎不表達(dá)CD34(1.17%)和CD45(7.12%)。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后油紅O染色顯示胞漿紅色脂滴形成，成骨誘導(dǎo)2周后茜素紅S染色顯示紅色鈣結(jié)節(jié)形成。選擇感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection, MOI)為10轉(zhuǎn)染MSCs，轉(zhuǎn)染后72h熒光顯微鏡下觀察，絕大部分MSCs呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，eGFP轉(zhuǎn)染陽性率約90%。轉(zhuǎn)染后MSCs形態(tài)仍為梭形，生長良好，未見明顯毒性反應(yīng)，傳代后熒光表達(dá)穩(wěn)定。 2. STZ注射3天后，大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿、精神萎靡、活動減少、反應(yīng)遲鈍、鼠毛稀疏、晦暗無光澤等體征，連續(xù)3天監(jiān)測隨機(jī)血糖濃度均大于16.7mmol/L，提示1型糖尿病模型建立成功。糖尿病模型成功建立后4周，血糖值穩(wěn)定在20.8-33.8mmol/L之間，大鼠出現(xiàn)微量白蛋白尿，UAER值從(18.64±6.43μg/mg，對照組)升高至(46.79±15.42μg/mg，糖尿病腎病組)。胰腺及腎臟病理學(xué)均提示早期糖尿病腎病模型成功復(fù)制。 3.①熒光顯微鏡計數(shù)并比較MSCs組與超聲+微泡+MSCs組腎內(nèi)eGFP陽性細(xì)胞數(shù)，分別為(5.7±0.8)個，(18.3±2.9)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。eGFP標(biāo)記的MSCs主要位于腎間質(zhì)毛細(xì)血管外、管周區(qū)域，少數(shù)位于腎小球。②超聲聯(lián)合微泡組腎內(nèi)EB藍(lán)染面積最明顯，表面與冠狀面藍(lán)染面積分別為(49.12±7.31)%和(37.99±4.36)%，超聲組腎內(nèi)有輕微藍(lán)染，表面與冠狀面藍(lán)染面積分別為(9.37±3.45)%和(10.10±3.24)%，對照組和微泡組未見藍(lán)染。③超聲聯(lián)合微泡組的EB含量(37.267±4.948μg/g)明顯高于對照組(13.942±2.848μg/g)、超聲組(14.126±2.570μg/g)、微泡組(13.969±2.076μg/g)和恢復(fù)組(14.658±3.916μg/g)。④激光共聚焦結(jié)果顯示超聲+微泡組腎間質(zhì)毛細(xì)血管周圍EB滲出較其他組為明顯，似呈“漁網(wǎng)狀”，余各組未見EB滲出。⑤透射電鏡觀察到超聲輻照后間質(zhì)毛細(xì)血管壁變薄，變得不連續(xù)、不光滑，對照組、超聲組和微泡組的間質(zhì)毛細(xì)血管保持完整。⑥超聲+微泡組E-selectin的mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于對照組、超聲組和微泡組。⑦腎臟HE染色后觀察，各組腎臟組織沒有出血、壞死和腎臟結(jié)構(gòu)的改變。⑧各組之間UAER值沒有統(tǒng)計學(xué)差異。⑨各組未見血尿。 4.①細(xì)胞治療后1周，MSCs組和超聲+微泡+MSCs組血糖濃度明顯降低。細(xì)胞移植后第2周，血糖濃度降到最低水平并持續(xù)至整個實(shí)驗階段。細(xì)胞治療后8周，MSCs組和超聲+微泡+MSCs組，血糖濃度無明顯差異(23.8±5.5mmol/L24.0±4.6mmol/L,P=0.395)。未治療組和超聲+微泡組直至實(shí)驗結(jié)束仍保持較高血糖水平，濃度分別為(28.4±6.2) mmol/L及(27.9±6.5) mmol/L。②細(xì)胞治療后8周，與正常組(25.27±2.34mIU/L)相比，未治療組和超聲+微泡組的血漿胰島素水平明顯降低，分別為(16.42±2.17) mIU/L和(16.67±2.33) mIU/L，二者之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，而MSCs組和超聲+微泡+MSCs組的血漿胰島素水平有所上升，分別為(19.31±1.68) mIU/L和(19.53±1.59) mIU/L，二者之間也無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。③細(xì)胞治療后8周，未治療組和超聲+微泡組的UAER值均保持較高水平，分別為(643.25±204.58) μg/mg和(637.29±212.24) μg/mg。該值約4倍高于同時期正常組大鼠UAER值(128.57±36.93μg/mg)。MSCs組和超聲+微泡+MSCs組的UAER值明顯降低，分別為(302.41±49.21) μg/mg和(252.83±39.58) μg/mg。盡管MSCs組和超聲+微泡+MSCs組的UAER值均未降至正常水平，但超聲+微泡+MSCs組的UAER水平明顯低于MSCs組。④MSCs治療后8周，，未治療組和超聲+微泡組大鼠腎小球基底膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)增生，系膜區(qū)增寬，足突廣泛融合、增寬；腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)可見髓鞘樣結(jié)構(gòu)，小管上皮細(xì)胞微絨毛腫脹，線粒體腫脹并伴大量空泡變。MSCs組大鼠腎小球基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)增生以及系膜區(qū)增寬情況減輕，小部分足突融合，大部分修復(fù)；腎小管上皮細(xì)胞部分線粒體腫脹伴少量空泡變性。超聲+微泡+MSCs組大鼠腎小球基底膜大部分未見明顯增厚，細(xì)胞外基質(zhì)增生明顯減輕，系膜區(qū)未見增寬，足突融合明顯好轉(zhuǎn)；腎小管上皮細(xì)胞線粒體輕度腫脹，未見明顯空泡變性。⑤腎臟PAS染色顯示，至整個實(shí)驗結(jié)束，未治療組與超聲+微泡組的腎小球和腎小管在光鏡下有類似改變，均表現(xiàn)為腎小球硬化、體積增大、基底膜增厚、系膜區(qū)增寬、系膜基質(zhì)增生和腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性。MSCs組和超聲+微泡+MSCs組上述情況均明顯好轉(zhuǎn)，MSCs組僅有一小部分腎小球硬化和腎小管擴(kuò)張，超聲+微泡+MSCs組光鏡下可觀察到幾乎正常的腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)。⑥胰腺HE染色和胰腺組織免疫熒光雙標(biāo)檢查均顯示，未治療組和超聲+微泡組胰島和胰島β細(xì)胞大面積破壞，與正常組胰島或胰島β細(xì)胞相比，胰島形態(tài)不規(guī)則、體積減小、胰島素生成細(xì)胞數(shù)量減少并向周邊分布，而胰高血糖素生成細(xì)胞數(shù)量增多并向中央分布。MSCs移植治療后8周，MSCs組和超聲+微泡+MSCs組胰島或胰島β細(xì)胞無論在數(shù)量、結(jié)構(gòu)或是體積上均明顯改善，經(jīng)治療后的胰島素生成細(xì)胞重新向胰島中央分布，胰高血糖素生成細(xì)胞重回周邊分布。⑦免疫組織化學(xué)法檢測TGF-β1在正常組中有少量表達(dá)，在未治療組和超聲+微泡組中強(qiáng)表達(dá)，MSCs組表達(dá)次之，超聲+微泡+MSCs組弱表達(dá)，半定量分析后顯示，超聲+微泡+MSCs組與MSCs組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。⑧ELISA法檢測IL-10在正常腎組織中高表達(dá)，未治療組和超聲+微泡組中表達(dá)明顯降低，而MSCs組表達(dá)增加，超聲+微泡+MSCs組表達(dá)進(jìn)一步增加。 結(jié)論： 1.成功實(shí)現(xiàn)大鼠MSCs的分離、培養(yǎng)及純化，骨髓貼壁法是獲取、純化、擴(kuò)增MSCs簡便、易行的方法。通過生長曲線、細(xì)胞周期、透射電鏡等生物學(xué)特性檢測，提示培養(yǎng)的MSCs呈低分化狀態(tài)，有較強(qiáng)的自我更新能力。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記分子，以及體外成脂、成骨誘導(dǎo)分化，初步判定所獲細(xì)胞為MSCs。 2.腹腔單次注射鏈脲霉素(60mg/Kg)可建立穩(wěn)定的大鼠1型糖尿病腎病模型，隨機(jī)血糖濃度和UAER可有效評價模型是否成功建立。 3. eGFP轉(zhuǎn)染MSCs可有效示蹤MSCs在靶器官的分布，按照MOI=10轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后無明顯毒性且熒光表達(dá)穩(wěn)定，其方法簡便，操作便捷，可應(yīng)用于MSCs的標(biāo)記。 4.診斷超聲介導(dǎo)的微泡破壞技術(shù)可增加糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)毛細(xì)血管通透性，為經(jīng)靜脈移植的MSCs歸巢并修復(fù)受損腎臟提供了研究基礎(chǔ)。其可能機(jī)制為超聲介導(dǎo)的微泡破壞所產(chǎn)生的空化效應(yīng)可刺激超聲輻照區(qū)域腎間質(zhì)毛細(xì)血管的破裂及局部炎癥發(fā)生，上調(diào)E-selectin炎癥因子的表達(dá)，改變微環(huán)境，進(jìn)而增加移植的MSCs向受損腎臟聚集與歸巢。 5.超聲介導(dǎo)的微泡破壞技術(shù)在合適的參數(shù)下對腎臟可能是安全的，對大鼠腎臟濾過功能沒有影響。腎間質(zhì)毛細(xì)血管通透性的增加是可逆的，24小時后可恢復(fù)到正常水平。 6.診斷超聲介導(dǎo)的微泡破壞產(chǎn)生的空化效應(yīng)通過增加間質(zhì)毛細(xì)血管通透性、增加炎癥因子E-selectin的表達(dá)，局部改變微環(huán)境，促進(jìn)更多的外源性MSCs黏附、聚集、歸巢至腎間質(zhì)，抑制促纖維化因子TGF-β1表達(dá)，減輕腎小管和間質(zhì)損害，阻止糖尿病腎病的進(jìn)程。 7. MSCs移植通過旁分泌效應(yīng)產(chǎn)生抗炎因子IL-10，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子/抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而減輕腎小球增大和腎小管擴(kuò)張程度，延緩腎損害，保護(hù)腎臟。 8. MSCs移植降低血糖濃度，促進(jìn)胰島恢復(fù)，有效遏制糖尿病腎病的進(jìn)程，對促進(jìn)腎臟修復(fù)產(chǎn)生積極作用。
【圖文】：

流式細(xì)胞儀檢測第2代MSCs的細(xì)胞周期：處于G0+G1期細(xì)胞比例為71.9%

式細(xì)胞儀檢測第 2 代 MSCs 的細(xì)胞周期：處于 G0+G1 期細(xì)胞比T 檢測 MSCs 生長曲線分析3、5 代細(xì)胞的生長規(guī)律基本一致，首先經(jīng)過 1～2d 滯留，第 7d 達(dá)到平臺期，此時細(xì)胞數(shù)目不再增加。隨著代趨勢(圖 2-2)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R445.1;R587.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2621050