【摘要】：第一部分葉酸靶向高分子材料的制備和鑒定 目的制備葉酸靶向的聚乳酸-羥基乙酸/聚乙二醇高分子材料(PLGA-PEG-FA),建立制備關(guān)鍵步驟過程控制的檢測(cè)方法并鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu),檢測(cè)其體外靶向的特異性。 方法采用五步法制備PLGA-PEG-FA: ①合成PLGA-NHS: ②合成單氨基保護(hù)的NH2-PEG-BOC； ③PLGA.NHS與PEG連接； ④PLGA-PEG-NH-BOC氨基脫保護(hù),得PLGA-PEG-NH2； ⑤PLGA-PEG-FA的合成。 以薄層層析法和核磁共振氫譜監(jiān)控合成的關(guān)鍵過程,以核磁共振氫譜對(duì)終產(chǎn)品PLGA-PEG-FA進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證,用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)體外靶向特異性。 結(jié)果 ①PLGA-NHS的核磁共振氫譜可見在化學(xué)位移值為2.6ppm處形成一新峰,與NHS的亞甲基峰一致。氫譜結(jié)果表明PLGA-NHS結(jié)構(gòu)正確,NHS成功的置換了原PLGA上的羧基； ②薄層層析結(jié)果：陽性對(duì)照PEG和PLGA-PEG-NH2展開后均顯色非常明顯,提示PEG已通過化學(xué)鍵和PLGA成功連接； ③PLGA-PEG-FA聚合物用核磁共振氫譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定其結(jié)構(gòu)正確； ④流式細(xì)胞檢測(cè)到隨著PLGA-PEG-FA的量增加,SKOV3陽性細(xì)胞數(shù)大幅增加,達(dá)一定濃度時(shí),已達(dá)到飽和(接近100%),陽性細(xì)胞數(shù)不再增加,結(jié)合呈“S”型曲線,符合受體和配體結(jié)合規(guī)律。當(dāng)先加入不同濃度的FA和SKOV3共同孵育后,隨著FA濃度的增加,陽性細(xì)胞數(shù)迅速減少,當(dāng)FA達(dá)到一定量后,已經(jīng)檢測(cè)不到陽性細(xì)胞。提示FA競(jìng)爭(zhēng)性抑制了PLGA-PEG-FA與SKOV3上FR的結(jié)合。 結(jié)論 ①成功制備PLGA-PEG-FA高分子材料,純度98%,結(jié)構(gòu)正確,可特異性和細(xì)胞上FR結(jié)合； ②成功建立了PLGA-PEG-FA的制備方法,過程可控,獲得重要的過程控制參數(shù)； ③核磁共振氫譜和薄層層析法可用與NHS活化和PEG連接兩步關(guān)鍵步驟的過程控制； ④為制備葉酸靶向相變載金高分子造影劑奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 第二部分葉酸靶向相變載金高分子超聲及光聲造影劑的制備及其性質(zhì)研究 目的利用第一部分已成功制備的葉酸靶向高分子材料(PLGA-PEG-FA)包裹全氟戊烷(PFP)和納米金(GNP),制備葉酸靶向相變載金高分子超聲和光聲造影劑(GNP/PFP/PLGA-PEG-FA)建立并優(yōu)化制備方法,檢測(cè)高分子超聲和光聲造影劑的物理學(xué)特性和體外靶向的特異性。 方法 ①制備相變型造影劑：雙乳化法制備分別包裹PFP和全氟己烷(PFH)的納米造影劑,采用精密恒溫控制器加熱、水浴及低強(qiáng)度聚焦超聲三種方法觀察兩種造影劑相變的條件,從而確定選用PFP或PFH作為相變?cè)煊皠┑膬?nèi)核； ②制備葉酸靶向相變載金高分子造影劑：在成功制備相變型造影劑的基礎(chǔ)上,采用雙乳化法制備葉酸靶向相變載金高分子造影劑。用精密恒溫控制器逐步加溫,光學(xué)顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察相變情況,比較載金與不載金高分子造影劑相變溫度的差異、高強(qiáng)度聚集超聲促發(fā)相變的差異以及激光輻照激發(fā)相變的差異； ③優(yōu)化GNP/PFP/PLGA-PEG-FA高分子造影劑制備條件：采用破壞微球法,測(cè)定包裹量,根據(jù)包裹量確定PFP和PLGA-PEG-FA最佳質(zhì)量比；采用激光輻照后光鏡下觀察相變產(chǎn)生氣泡量確定GNP和PLGA-PEG-FA最佳質(zhì)量比； ④GNP/PFP/PLGA-PEG-FA高分子超聲和光聲造影劑的一般理化性質(zhì)檢測(cè)：包括濃度、pH計(jì)、掃描電鏡、投射電鏡、粒徑、電位；采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其體外靶向特異性。 結(jié)果 ①兩種相變型納米造影劑PFP/PLGA-PEG-FA和PFH/PLGA-PEG-FA在常規(guī)二維超聲下表現(xiàn)均為密集點(diǎn)狀高回聲,分布均勻。粒徑分布集中,呈單峰。前者恒溫控制器加溫和水浴的相變溫度分為43℃和42℃,后者分別為71℃和68℃；LIFU均可促發(fā)二者相變,但前者相變需要的能量更低； ②載金后的相變型造影劑(GNP/PFP/PLGA-PEG-FA)與非載金(PFP/PLGA-PEG-FA)(?)匕較,相變溫度無明顯差異；高強(qiáng)度聚集超聲(HIFU)可激發(fā)二者相變,激發(fā)強(qiáng)度無明顯差異；激光輻照后,前者可發(fā)生相變,而后者不發(fā)生相變。溫度、HIFU和激光輻照均不能激發(fā)只載金的造影劑(GNP/H20/PLGA-PEG-FA)發(fā)生相變； ③PFP和PLGA的最佳質(zhì)量比約為11：1時(shí),包裹率最高；GNP和PLGA的質(zhì)量比約為1：12.5時(shí),激光輻照后,相變最強(qiáng)； ④一般理化特性：外觀呈棕黑色混懸液；濃度為3.657x1015個(gè)/ml；pH值為7.12；粒徑為(268.1±90.87)mn,Zeta電位為(-67.6+12.7)mV。掃描電鏡下呈球形,形態(tài)規(guī)則,大小尚均勻,分散度好；透射電鏡下可見納米金呈不規(guī)則團(tuán)片狀顆粒樣不均勻地分布于納米粒上； ⑤流式細(xì)胞檢測(cè)：隨著GNP/PFP/PLGA-PEG-FA高分子造影劑量的增加,細(xì)胞膜上表達(dá)FR的SKOV3和HL-60細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)大幅增加,當(dāng)加入的量到達(dá)一定濃度時(shí),陽性細(xì)胞數(shù)不再增加,結(jié)合呈“S”型曲線,符合受體和配體結(jié)合規(guī)律。不表達(dá)FR的Wish(?)田胞始終未檢測(cè)到陽性細(xì)胞。當(dāng)先加入不同濃度的FA和SKOV3共同孵育后,隨著FA濃度的增加,陽性細(xì)胞數(shù)迅速減少,當(dāng)FA達(dá)到一定量后,已經(jīng)檢測(cè)不到陽性細(xì)胞。 結(jié)論 ①以PLGA-PEG-FA為膜材包裹后,PFP的相變條件比PFH更接近生理?xiàng)l件,選擇PFP為相變材料可兼顧診斷與治療的需求； ②載GNP后,不影響溫度和聲致相變的條件,增加了光致相變的特性,使本造影劑具有多模態(tài)顯像的潛力； ③一般理化性質(zhì)表明GNP/PFP/PLGA-PEG-FA高分子造影劑為形態(tài)規(guī)則,大小均勻的納米微球； ④本造影劑可與兩種高表達(dá)不同F(xiàn)R亞型的細(xì)胞結(jié)合,FA可競(jìng)爭(zhēng)性抑制這種結(jié)合,而與不表達(dá)FR的細(xì)胞不結(jié)合,均提示本造影劑與FR特異性結(jié)合； ⑤溫度、HIUF、LIUF以及激光均可激發(fā)GNP/PFP/PLGA-PEG-FA相變。即本造影劑具備超聲造影劑和光聲造影劑的特性； ⑥以上提示本研究成功的制備了葉酸靶向相變載金高分子超聲和光聲造影劑(GNP/PFP/PLGA-PEG-FA)。 第三部分葉酸靶向相變載金高分子超聲及光聲造影劑增強(qiáng)超聲顯像的研究 目的研究葉酸靶向相變載金高分子超聲及光聲造影劑(GNP/PFP/PLGA-PEG-FA)在體內(nèi)、外通過聲致相變和光致相變后增強(qiáng)超聲顯像的作用。 方法 ①體外聲致相變和光致相變后增強(qiáng)超聲顯像的作用。實(shí)驗(yàn)分為GNP/PFP/PLGA-PEG-FA組,以GNP/H2O/PLGA-PEG-FA為對(duì)照；PFP/PLGA-PEG-FA組,以H0O/PLGA-PEG-FA為對(duì)照。分別采用LIFU作用和激光輻照,觀察LIFU和激光作用前后的基波和諧波超聲顯像； ②離體組織中聲致相變和光致相變后增強(qiáng)超聲顯像的作用。分別采用局部注射與灌注兩種方式,在離體豬肝上觀察GNP/PFP/PLGA-PEG-FA和PFP/PLGA-PEG-FA造影劑在LIFU作用和激光輻照后基波和諧波超聲顯像,同時(shí)觀察超聲造影劑聲諾維的離體組織灌注表現(xiàn)； ③以SKOV3裸鼠荷瘤模型研究造影劑在體內(nèi)聲致相變和光致相變后增強(qiáng)腫瘤超聲顯像的作用。實(shí)驗(yàn)分為GNP/PFP/PLGA-PEG-FA和PFP/PLGA-PEG-FA兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組,以超聲造影劑聲諾維為對(duì)照。采用腹腔注射。聲諾維注射前后觀察腫瘤內(nèi)造影劑進(jìn)入及消退的過程。兩實(shí)驗(yàn)組分別在腹腔注射后即刻、20mmin、2h和4h采用LIFU作用和激光輻照,每次作用前后觀察腫瘤的基波和諧波超聲顯像。 結(jié)果 ①LIFU作用后,含有液態(tài)氟碳PFP的兩種造影劑：GNP/PFP/PLGA-PEG-FA及PFP/PLGA-PEG-FA在諧波模式下可見到較多點(diǎn)狀高回聲出現(xiàn),而不含液態(tài)氟碳的兩種造影劑：GNP/H2O/PLGA-PEG-FA及H2O/PLGA-PEG-FA超聲基波與諧波模式圖像均無明顯改變。激光輻照后,僅載金的造影劑(即GNP/PFP/PLGA-PEG-FA)在諧波模式下可見到較多點(diǎn)狀高回聲出現(xiàn)。而其他三種不載金的造影劑超聲圖像均無明顯改變； ②離體局部注射兩種GNP/PFP/PLGA-PEG-FA和PFP/PLGA-PEG-FA造影劑后,以LIFU及激光促發(fā),結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)完全一致。離體肝臟組織局部灌注聲諾維后,諧波下可觀察到造影劑的增強(qiáng)回聲分布于肝實(shí)質(zhì)并達(dá)肝包膜下方。兩種自制造影劑灌注結(jié)束后,該區(qū)域的肝實(shí)質(zhì)在基波下回聲增強(qiáng)不明顯,諧波下未見明顯顯像。LIFU作用于灌注區(qū)域后,作用區(qū)域基波及諧波下回聲均增強(qiáng),諧波下回聲增強(qiáng)更明顯。激光輻照后,僅有GNP/PFP/PLGA-PEG-FA組作用區(qū)域基波及諧波下回聲均增強(qiáng),諧波下回聲增強(qiáng)更明顯； ③腹腔注射聲諾維后,在造影模式下,約30S左右時(shí)可見腫瘤開始顯影,呈不均勻的高增強(qiáng),5min后造影劑基本消退。腹腔注射GNP/PFP/PLGA-PEG-FA后即刻、20mmin、2h和4h分別采用LIFU作用和激光輻照,每次作用前基波與諧波下均無明顯改變,腹腔注射完即刻用LIFU作用和激光輻照,作用區(qū)在基波下可見回聲增強(qiáng),諧波下增強(qiáng)更明顯,未受到促發(fā)的區(qū)域回聲無改變。20分鐘后,兩種方式再次促發(fā)后,基波與諧波下仍可觀察到明顯增強(qiáng)顯像。2小時(shí)后,兩種方式第三次促發(fā)后,基波與諧波下仍可觀察到增強(qiáng)顯像,但強(qiáng)度減弱。4小時(shí)后,第四次促發(fā)后,未觀察到增強(qiáng)顯像。腹腔注射PFP/PLGA-PEG-FA后,在各個(gè)時(shí)點(diǎn)以LIFU作用后觀察到與GNP/PFP/PLGA-PEG-FA一致的增強(qiáng)顯像,但各個(gè)時(shí)點(diǎn)以激光輻照前后均未觀察到增強(qiáng)顯像。 結(jié)論 ①在體外,LIFU和激光均可致GNP/PFP/PLGA-PEG-FA相變,增強(qiáng)超聲顯像； ②在離體組織中,LIFU和激光均也可致GNP/PFP/PLGA-PEG-FA相變,增強(qiáng)超聲顯像； ③在體內(nèi),GNP/PFP/PLGA-PEG-FA的留存時(shí)間顯著延長(zhǎng),通過LIFU和激光促發(fā)后,均可在作用區(qū)域發(fā)生觀察到增強(qiáng)顯像； ④GNP/PFP/PLGA-PEG-FA的顯像與聲諾維不同,只有在受到外界能量促發(fā)才能在相應(yīng)區(qū)域顯像。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R445.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2355472