本文關鍵詞：當歸多糖對輻射損傷小鼠骨髓單個核細胞氧化損傷及凋亡影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《重慶醫(yī)科大學》 2012年

當歸多糖對輻射損傷小鼠骨髓單個核細胞氧化損傷及凋亡影響的研究

何曉莉  

【摘要】：電離輻射作用于機體可誘發(fā)大量自由基產生，而自由基作用于DNA、RNA等生物大分子，可致使其結構改變和生物活性喪失，從而造成機體發(fā)生氧化損傷。超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）是一種普遍存在于微生物及動植物中的金屬酶，它可以催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應，清除自由基，從而保護受損細胞，并對機體的氧化及抗氧化平衡起著非常重要的作用。丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)是過氧化脂質的降解產物，通過檢測MDA的含量可以判斷脂質過氧化反應的程度，從而間接反應細胞損傷情況。 細胞凋亡(apoptosis，AP)是指細胞在受到某些因素刺激或接受某種信號后的一種主動的，由大量凋亡相關基因相互作用的細胞消亡的過程。它是一個多因素參與的、復雜的生物學過程。電離輻射所致細胞凋亡的信號通路主要有：依賴于DNA損傷、依賴于胞質電離損傷、依賴于質膜損傷和SAPK／JNK4種。P53、Bc1-2、Caspase-3在電離輻射誘導細胞凋亡的過程中發(fā)揮著重要作用。電離輻射誘發(fā)細胞凋亡是通過P53依賴的方式來誘導死亡受體Fas及其配體FasL的表達。Bc1-2是細胞凋亡相關基因研究中最被關注的蛋白質之一，在輻射損傷中其主要作用是抑制輻射誘導的細胞凋亡。Caspase-3是細胞凋亡過程中極其重要的執(zhí)行分子之一，它能夠剪切細胞凋亡過程中的許多非常關鍵地蛋白，其激活通常需要從無活性的全長Caspase-3(35KD)的Asp28和Ser29之間及Asp175和Ser176之間進行剪切，產生有活性的亞基（17KD和12KD），其激活常被認為是細胞凋亡的一個非常重要的指標。 骨髓對電離輻射高度敏感。骨髓單個核細胞(bonemarrowmononuclearcell，BMNC）主要包括淋巴細胞和單核細胞。輻射損傷可使BMNC數量減少，細胞周期阻滯，細胞發(fā)生氧化損傷及凋亡等。 當歸多糖（angelicapolysaccharides，APS）是傳統(tǒng)補血活血中藥——當歸的主要活性成分之一。研究表明：它具有影響造血系統(tǒng)、抗輻射、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒及調節(jié)免疫等功能。目前，APS抗輻射的具體機制并不十分明確。本實驗是在建立C57BL/6小鼠急性放射損傷實驗動物模型的基礎上，研究APS對急性放射損傷小鼠BMNC氧化損傷及細胞凋亡的影響，旨在探討APS抗輻射的分子機制，為輻射保護劑的開發(fā)提供理論依據。 目的：研究APS對急性放射損傷小鼠BMNC氧化損傷、增殖能力、細胞凋亡率以及凋亡相關蛋白表達的影響，進而了解APS抗輻射的分子機制。 方法： 1.C57BL/6小鼠隨機分為10組，，正常組(不作任何處理)；生理鹽水（normalsaline，NS）組、2mg/kgAPS組和8mg/kgAPS組，后3組根據時間點分別再分為第1d、3d、7d組，共計9組。此9組小鼠采用直線加速器X線全身均勻照射，總劑量為4.0Gy，時間1.25min，吸收劑量率3.76Gy/min，焦點距鼠100cm，面積約25×25cm~2。照射后于3h內腹腔分別注射NS、2mg/kgAPS和8mg/kgAPS，連續(xù)注射7d（每天注射一次，注射前稱重，根據小鼠體重分別計算出相應注射體積），于照射后第1、3、7d處死小鼠，常規(guī)方法提取其BMNC。 2.比色法檢測各組小鼠BMNC的SOD活性及MDA含量。 3.流式細胞儀（flowcytometry，FCM）檢測各組小鼠BMNC細胞周期。 4.FCM檢測各組小鼠BMNC凋亡率。 5.FCM檢測各組小鼠BMNCBcl-2的表達率。 6.免疫細胞化學法和蛋白免疫印跡法（WesternBlot，WB）檢測各組小鼠BMNCP53的表達。 7.WB檢測各組小鼠BMNCCaspase-3的表達。 結果： 1.實驗小鼠急性放射損傷模型的建立：造模成功后NS組小鼠表現為飲水量增加，進食量減少，偶有腹瀉、血便；皮毛略顯凌亂，易脫落；活動顯遲緩，嗜睡，小鼠之間相互靠攏。各APS治療組小鼠上述癥狀相對減輕。 2.APS對放射損傷后小鼠BMNCSOD活性及MDA含量的影響：照射后第1、3、7dNS組與正常組相比，BMNC的SOD活性顯著降低、MDA含量明顯升高（P0.05）；2mg/kgAPS組和NS組同一時間點比較，BMNCSOD活性增加，MDA含量降低，但差異均無顯著性（P0.05）；8mg/kgAPS組較NS組同一時間點比較，BMNC的SOD活性顯著增加（P0.05），但仍低于正常組，MDA含量顯著降低（P0.05），但仍高于正常組。 3.APS對放射損傷后小鼠BMNC周期（G_0/G_1期）改變的影響：照射后第1、3、7dNS組BMNC停滯于G_0/G_1期，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2mg/kgAPS組與NS組(1、3d)比較，其G_0/G_1期比例有所下降，但差異無顯著性（P0.05）；2mg/kgAPS組(7d)及8mg/kgAPS組與NS組同一時間點比較，G0/G1期比例顯著性降低(P0.05)，但仍高于正常組。 4.APS對放射損傷后小鼠BMNC凋亡率的影響：照射后第1、3、7dNS組BMNC的凋亡率均較正常組顯著增高（P0.05）；2mg/kgAPS組BMNC凋亡率較NS組在照射后第1d、3d有所下降，但差異不顯著(P0.05)；2mg/kgAPS組(7d)及8mg/kgAPS組與NS組同一時間點比較，細胞凋亡率顯著下降（P0.05），但仍高于正常組。 5.APS對放射損傷后小鼠BMNCBcl-2蛋白表達率的影響：照射后第1、3、7dNS組BMNC的Bcl-2表達率均較正常組顯著降低（P0.05）；2mg/kgAPS組BMNCBcl-2表達率較NS組在照射后第1d、3d有所升高，但差異不顯著(P0.05)；2mg/kgAPS組(7d)及8mg/kgAPS組與NS組同一時間點比較，Bcl-2表達率升高顯著（P0.05），但仍低于正常組。 6.APS對放射損傷后小鼠BMNCP53蛋白表達的影響：免疫細胞化學結果顯示：正常組小鼠BMNC不表達P53，NS組、2mg/kgAPS、8mg/kgAPS組P53的表達率明顯升高，但上述三組各時間點間表達均無顯著差異。WB結果顯示：照射后第1、3、7dNS組BMNC的P53均較正常組顯著增高（P0.05）；2mg/kgAPS組與NS組同一時間點相比，P53蛋白的表達有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；8mg/kgAPS組與NS組同一時間點相比，P53蛋白的表達降低明顯（P0.05）。 7.APS對放射損傷后小鼠BMNCCaspase-3蛋白表達水平的影響：正常組的Caspase-3未被激活，只表達全長片段（35KD），不表達激活片段（12+17KD）。照射后NS組各時間點與正常組比較，Caspase-3的全長片段表達較顯著降低、激活片段表達顯著增加（P0.05）；2mg/kgAPS組與NS組同一時間點相比，全長片段表達有所增加，激活片段表達有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；8mg/kgAPS各組與NS組同一時間點相比，全長片段表達增加、激活片段表達降低（P0.05）。 結論：APS不僅能提高輻射損傷小鼠BMNC的SOD活性，降低其MDA含量；它還能減輕細胞周期阻滯、減少細胞凋亡率、降低P53總蛋白及Caspase-3激活片段表達、升高Bcl-2表達率，從而對輻射損傷小鼠具有保護作用。8mg/kgAPS組與2mg/kgAPS組相比，抗輻射效果更明顯。其機制可能是：APS通過提高SOD活性，減少MDA含量，導致輻射損傷后BMNC自由基含量減少，從而減輕DNA損傷；同時APS可降低P53表達，減少細胞周期阻滯，上調Bcl-2表達水平，減少Caspase-3激活，最終減輕細胞凋亡。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R285.5;R818
【目錄】：

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