本文關(guān)鍵詞：脂肪來源干細(xì)胞治療小鼠放射性涎腺損傷的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第四軍醫(yī)大學(xué)》 2014年

脂肪來源干細(xì)胞治療小鼠放射性涎腺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

胡翰青  

【摘要】：【背景】 頭面部頸部惡性腫瘤日益多發(fā)，手術(shù)治療是一種主要的治療手段，但很多患者仍需要接受放射治療，，其中主要并發(fā)癥之一就是導(dǎo)致與癌腫位置毗鄰的正常腺體組織受損，從而致使涎腺正常功能出現(xiàn)損害，引起口干癥，黏膜慢性炎癥，猛性齲齒等多種并發(fā)癥。目前臨床治療技術(shù)限于對(duì)癥治療，治標(biāo)難治本。近年來組織工程中干細(xì)胞治療技術(shù)的廣泛研究為涎腺組織再生提供了一條可行之路。 【目的】 研究脂肪來源干細(xì)胞（dipose-derived stem cells，ASCs）對(duì)放射性損傷涎腺的治療作用。觀察注射ASCs能否體內(nèi)轉(zhuǎn)分化為腺泡細(xì)胞，重建涎腺的分泌功能，促進(jìn)涎腺再生。為ASCs復(fù)合體治療涎腺再生提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及對(duì)照。為涎腺功能障礙和涎腺損傷的治療提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【方法】 1.建立小鼠涎腺局部放射損傷動(dòng)物模型：選取60只6周齡雌性C57小鼠，麻醉后下頜下腺局部照射。實(shí)驗(yàn)組分成5組，每組10只小鼠，直線加速器分別給予單次12Gy，15Gy，18Gy，21Gy，24Gy的下頜下腺局部照射，另設(shè)一組空白對(duì)照組，數(shù)量同為10只小鼠。SPF條件飼養(yǎng)，觀察放射后生存情況；測體重，測血常規(guī)；放射前，放射后3月及6月測定各組小鼠唾液流量及唾液淀粉酶含量，取各組小鼠下頜下腺切片，行組織學(xué)檢測，內(nèi)容包括HE染色、PAS染色、透射電鏡觀察、細(xì)胞凋亡檢測。觀察放射后涎腺受損情況。測定建立小鼠涎腺局部放射損傷模型最佳劑量及干細(xì)胞體內(nèi)移植的最佳時(shí)間節(jié)點(diǎn)。選取最佳照射劑量行小鼠下頜下腺局部照射，建立小鼠涎腺局部放射損傷動(dòng)物模型。 2.小鼠ASCs體外分離、培養(yǎng)和相關(guān)鑒定：取材動(dòng)物選擇2周齡雄性C57小鼠，無菌條件下手術(shù)切取腹股溝處脂肪組織，常規(guī)消化，分離及培養(yǎng)細(xì)胞。測生長曲線，細(xì)胞表面標(biāo)志物等，體外行細(xì)胞成脂及成骨誘導(dǎo)并做鑒定。 3.體外熒光標(biāo)記小鼠ASCs，將其注射到動(dòng)物模型體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞歸巢示蹤實(shí)驗(yàn)：選取兩種C57小鼠ASCs，分別為普通C57小鼠及GFP轉(zhuǎn)基因C57小鼠。DiI及DEPI熒光染料對(duì)普通C57小鼠ASCs行體外染色。GFP轉(zhuǎn)基因C57小鼠ASCs僅體外行DEPI熒光染色，觀察結(jié)果并拍照。分別將熒光標(biāo)記的普通小鼠ASCs及GFP轉(zhuǎn)基因C57小鼠ASCs尾靜脈注射至動(dòng)物模型小鼠體內(nèi)。將DiI標(biāo)記的小鼠ASCs直接注射到動(dòng)物模型小鼠下頜下腺周圍，24h后切取動(dòng)物模型下頜下腺組織制成冰凍切片，DEPI熒光染料染色，熒光顯微鏡下觀察，拍照。 4.研究尾靜脈及腺體局部直接皮下注射ASCs對(duì)治療小鼠放射損傷涎腺的作用：共設(shè)5組，A：正常對(duì)照組；B：NS+尾靜脈注射組；C：ASCs+尾靜脈注射組；D：NS+腺體局部注射組；E：ASCs+腺體局部注射組。功能學(xué)檢測：完成干細(xì)胞注射3個(gè)月后對(duì)各組小鼠的唾液流量及唾液淀粉酶含量進(jìn)行測定，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組織學(xué)檢測：各組小鼠下頜下腺切片，HE染色、PAS染色、透射電鏡觀察、細(xì)胞凋亡檢測。測定細(xì)胞凋亡指數(shù)。觀察動(dòng)物模型腺泡細(xì)胞再生情況。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差檢驗(yàn)，P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 【結(jié)果】 1.成功構(gòu)建小鼠涎腺局部放射損傷動(dòng)物模型：局部放射劑量的大小與小鼠全身影響及下頜下腺損傷程度成正比關(guān)系。18Gy局部照射后小鼠體重及血細(xì)胞測定基本正常，但下頜下腺損傷嚴(yán)重，下頜下腺唾液流量及唾液淀粉酶含量分別下降66.7%及64%。HE染色及PAS染色顯示腺泡數(shù)量明顯減少。透射電鏡觀察見漿液細(xì)胞水腫變性。細(xì)胞凋亡檢測顯示有大量凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)為24±4.1%。相比18Gy照射3月，18Gy照射6月后腺體損傷進(jìn)一步加劇，小鼠唾液流量及唾液淀粉酶含量持續(xù)下降。HE染色及PAS染色顯示腺泡數(shù)量進(jìn)一步減少。漿液性細(xì)胞嚴(yán)重變性，染色質(zhì)邊集，胞核固縮。細(xì)胞凋亡指數(shù)51.9±3.9%，與18Gy照射3月組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 2.培養(yǎng)出小鼠ASCs，完成相關(guān)鑒定：細(xì)胞形態(tài)多為長梭形，呈漩渦狀排列。生長曲線呈S型；流式細(xì)胞分析CD29、CD90、CD44表達(dá)陽性，CD31、CD45、CD34表達(dá)陰性；成脂及成骨分化誘導(dǎo)結(jié)果鑒定均為陽性。 3.尾靜脈及腺體局部直接皮下注射ASCs混懸液后，在小鼠放射性損傷涎腺組織中發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的ASCs：DiI及DEPI熒光染料染色體外對(duì)ASCs標(biāo)記成功。熒光標(biāo)記的普通小鼠ASCs及GFP轉(zhuǎn)基因C57小鼠ASCs尾靜脈注射至動(dòng)物模型小鼠體內(nèi)后在小鼠下頜下腺出現(xiàn)；涎腺組織中也發(fā)現(xiàn)腺體局部注射標(biāo)記的ASCs。 4.完成脂肪來源干細(xì)胞注射后動(dòng)物模型受損涎腺組織功能學(xué)及形態(tài)學(xué)改善。 ①唾液流量及唾液淀粉酶含量C組及E組相較B組及D組明顯增加，但較A組（正常對(duì)照組）仍低，C及E組分別與其他各組統(tǒng)計(jì)學(xué)比較均有差異（P＜0.05），C組與E組，B組與D組兩兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 ②各組HE染色及PAS染色結(jié)果顯示C與E組相較B及D組腺泡明顯增多，組織形態(tài)改善。但較A組比較仍有差距。 ③下頜下腺體組織電鏡超微結(jié)構(gòu)：A組下頜下腺漿液細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。B組及E組可見漿液細(xì)胞水腫變性壞死，核固縮，酶原顆粒明顯減少。C組及F組，腺泡損害較輕，酶原顆粒較豐富，細(xì)胞水腫較輕。漿液細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整。 ④各組細(xì)胞凋亡檢測：凋亡指數(shù)A組0+4.4%，B組49.5±5.6%，C組31.7±3.6%，D組52.1±4.9%，E組27.6±6.4%。 B組，C組，D組，E組分別與A組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C組與E組，B組與D組兩兩組間比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無差異（P＞0.05）。C組與B組，D組比較、E組與B組，D組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均有差異（P＜0.05）。 【結(jié)論】 1．動(dòng)物模型18Gy局部照射組小鼠下頜下腺受損明顯，但全身影響較小。18Gy是建模的最佳局部照射劑量。確定此劑量為實(shí)驗(yàn)照射劑量，建立小鼠涎腺放射損傷的動(dòng)物模型。局部照射后較長時(shí)間內(nèi)腺泡細(xì)胞持續(xù)損失減少，照射后3月是進(jìn)行干細(xì)胞體內(nèi)移植的最佳時(shí)間節(jié)點(diǎn)。 2．ASCs含量豐富，取材方便，生長快，分化能力強(qiáng)，更易培養(yǎng)和消化傳代，是不可多得的組織工程種子細(xì)胞。 3．熒光標(biāo)記ASCs體內(nèi)注射后在小鼠受損腺體中出現(xiàn)了明確的干細(xì)胞歸巢現(xiàn)象，證實(shí)干細(xì)胞能特異性歸巢于小鼠受損涎腺組織。 4. ASCs尾靜脈或腺體局部注射均可能體內(nèi)轉(zhuǎn)化為腺泡細(xì)胞，部分修復(fù)重建小鼠損傷涎腺功能及組織形態(tài)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R818
【目錄】：

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