發(fā)布時(shí)間：2018-04-27 16:30

  本文選題：靶向超聲納米泡 + CA-125　； 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的:以CA-125抗體作為配體,制備一種靶向卵巢癌的新型超聲納米泡造影劑,鑒定其理化特性及其對(duì)卵巢癌高表達(dá)CA-125的OVCAR-3細(xì)胞的靶向性,并探討該造影劑對(duì)卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的特異增強(qiáng)顯像效果,以期建立敏感的實(shí)驗(yàn)性卵巢癌超聲早期診斷方法。方法:1.非靶向及靶向超聲納米泡造影劑的制備:將一定比例的DPPC、DPPA、DPPE和DSPE-PEG-COOH與氯仿、Pluronic L10溶液、甘油等混合均勻,采用干燥法、機(jī)械振蕩法等,制備非靶向超聲納米泡造影劑。通過EDC與NHS將CA-125抗體與非靶向超聲納米泡造影劑連接,制備靶向卵巢癌的超聲納米泡造影劑。2.非靶向及靶向超聲納米泡造影劑物理性質(zhì)評(píng)價(jià):DLS檢測(cè)儀檢測(cè)靶向及非靶向超聲納米泡的粒徑大小范圍、分散度;并用超聲診斷儀檢測(cè)靶向超聲納米泡體外超聲造影顯像效果。檢測(cè)三組不同溫度下(4℃組、25℃組、37℃組)靶向超聲納米泡在制備后三天內(nèi)的穩(wěn)定性及超聲造影顯像效果。模擬體內(nèi)環(huán)境下,分別檢測(cè)靶向及非靶向超聲納米泡的穩(wěn)定性。3.靶向超聲納米泡造影劑與二抗的結(jié)合試驗(yàn):往非靶向及靶向超聲納米泡分別加入帶有綠色熒光的二抗MUC16 SAB,于4℃下透析30min,離心兩次后,取上清液。用熒光顯微鏡分別觀察靶向及非靶向超聲納米泡表面熒光二抗的附著情況,從而了解靶向超聲納米泡與抗體的結(jié)合情況。4.靶向超聲納米泡造影劑的體外結(jié)合試驗(yàn):選擇人卵巢癌ovcar-3細(xì)胞(對(duì)ca-125呈陽(yáng)性表達(dá))及skov-3細(xì)胞(對(duì)ca-125呈陰性表達(dá))體外無菌條件下分別培養(yǎng)傳代,在第3-4代細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛期,分別將ovcar-3細(xì)胞和skov-3細(xì)胞固定。將固定好的ovcar-3細(xì)胞分為a組、b組,skov-3細(xì)胞分為c組、d組。a,c組加入帶有綠色熒光的非靶向超聲納米泡造影劑,b,d組加入帶有綠色熒光的靶向超聲納米泡造影劑,使納米泡與細(xì)胞充分反應(yīng)3h,用pbs洗滌4次。即刻用熒光顯微鏡分別觀察靶向及非靶向超聲納米泡在體外分別與卵巢癌ovcar-3細(xì)胞及skov-3細(xì)胞的結(jié)合情況,從而了解靶向超聲納米泡與靶標(biāo)的結(jié)合情況。5.靶向超聲納米泡造影劑的體內(nèi)應(yīng)用試驗(yàn):人卵巢癌ovcar-3細(xì)胞及skov-3細(xì)胞體外無菌條件下培養(yǎng)傳代,在第3-4代細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛期,balb/c雌性裸鼠皮下分別接種,分別建立人卵巢癌裸鼠ovcar-3細(xì)胞和skov-3細(xì)胞動(dòng)物模型。經(jīng)裸鼠尾靜脈分別注入攜帶ca-125抗體的靶向超聲納米泡、間隔兩天后再分別注入非靶向超聲納米泡造影劑,在造影前15秒開始采集圖像,連續(xù)采集10min動(dòng)態(tài)圖像。繪制時(shí)間-強(qiáng)度曲線,對(duì)比分析同種細(xì)胞同一腫瘤實(shí)質(zhì)分別注入非靶向及靶向超聲納米泡后超聲造影峰值強(qiáng)度、達(dá)鋒后1min、2min和5min超聲造影的增強(qiáng)強(qiáng)度及強(qiáng)度比值(同一腫瘤,靶向超聲納米泡強(qiáng)度值/非靶向超聲納米泡強(qiáng)度值)及兩種不同超聲納米泡的衰減斜率。6.病理檢查:一周后,經(jīng)裸鼠尾靜脈注入帶有綠色熒光的靶向超聲納米泡造影劑,15min后將動(dòng)物處死并切除腫瘤,用oct包埋并放置-80°c保存。將病理組織進(jìn)行切片并將細(xì)胞核經(jīng)藍(lán)色dapi染色,在熒光顯微鏡下觀察靶向超聲納米泡與人卵巢癌ovcar-3腫瘤組織及skov-3腫瘤組織的結(jié)合情況,從而了解靶向超聲納米泡與靶標(biāo)的結(jié)合情況。結(jié)果:1.dls檢測(cè)儀檢測(cè)靶向與非靶向超聲納米泡的平均粒徑大小分別為74.6±16.7nm、66.6±22.0nm,分散度分別為0.208±0.069,0.203±0.020。攜載大分子量ca-125抗體后靶向超聲納米泡體外超聲造影顯像效果顯示為點(diǎn)狀高回聲,細(xì)膩均勻。2.不同溫度下靶向超聲納米泡的穩(wěn)定性:4℃組在靶向超聲納米泡制備后第一天~制備后第三天可保持較小粒徑,25℃組和37℃組于制備后第二天開始粒徑明顯增大。體外超聲造影顯像效果顯示,4℃組和25℃組樣本于制備后三天內(nèi)仍可保持較好的超聲造影顯像效果,而37℃組樣本于制備后第一天超聲造影顯像效果明顯下降。3.模擬體內(nèi)環(huán)境下靶向及非靶向超聲納米泡的穩(wěn)定性:非靶向與靶向超聲納米泡在0-60min、0-4h內(nèi)的造影增強(qiáng)強(qiáng)度值變化曲線相似。4.靶向超聲納米泡造影劑與二抗的結(jié)合試驗(yàn):熒光顯微鏡下顯示靶向超聲納米泡樣本組中可呈現(xiàn)大量綠色熒光,非靶向超聲納米泡樣本組中綠色熒光極少,經(jīng)imagej定量分析,兩組綠色熒光值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),從而說明二抗與靶向超聲納米泡造影劑牢固、特異性地結(jié)合在一起。5.靶向超聲納米泡造影劑的體外結(jié)合試驗(yàn):熒光顯微鏡下,b組(靶向超聲納米泡組)ovcar-3細(xì)胞核周圍可見大量綠色熒光圍繞或黏附,而a組(非靶向超聲納米泡組)ovcar-3細(xì)胞核周圍未見或僅見極少量綠色熒光。而d組(靶向超聲納米泡組)和c組(非靶向超聲納米泡組),在skov-3細(xì)胞核周圍未見或僅見極少量綠色熒光。經(jīng)imagej定量分析結(jié)果提示,b組的總超聲納米泡熒光強(qiáng)度與細(xì)胞熒光強(qiáng)度比值(超聲納米泡的總熒光強(qiáng)度/細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度),與其余三組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),且卵巢癌ovcar-3細(xì)胞表面所結(jié)合的靶向超聲納米泡,最高可達(dá)該細(xì)胞表面所結(jié)合的非靶向超聲納米泡的12倍。6.靶向超聲納米泡造影劑的體內(nèi)應(yīng)用試驗(yàn):繪制tic曲線后,對(duì)比分析ovcar-3腫瘤細(xì)胞組,同一裸鼠腫瘤實(shí)質(zhì)分別注入靶向、非靶向超聲納米泡后峰值強(qiáng)度、達(dá)鋒后1min、2min和5min超聲造影增強(qiáng)的強(qiáng)度比值(同一腫瘤,靶向超聲納米泡強(qiáng)度值/非靶向超聲納米泡強(qiáng)度值)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。該組裸鼠腫瘤注入靶向超聲納米泡、非靶向超聲納米泡后起始相的平均衰減斜率分別為0.39±0.06、0.98±0.20,盡管靶向超聲納米泡起始相的平均衰減斜率低于非靶向超聲納米泡,但是經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn),對(duì)比分析該組同一裸鼠腫瘤實(shí)質(zhì)分別注入兩種不同超聲納米泡后起始相衰減斜率、終末相衰減斜率差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。而對(duì)比分析skov-3腫瘤細(xì)胞組,同一裸鼠腫瘤實(shí)質(zhì)分別注入靶向、非靶向超聲納米泡后峰值強(qiáng)度、達(dá)鋒后1min、2min和5min超聲造影增強(qiáng)的強(qiáng)度比值(同一腫瘤,靶向超聲納米泡強(qiáng)度值/非靶向超聲納米泡強(qiáng)度值)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。對(duì)比分析該組同一裸鼠腫瘤實(shí)質(zhì)分別注入兩種不同超聲納米泡后起始相衰減斜率、終末相衰減斜率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。7.病理檢查:熒光顯微鏡下對(duì)ca-125呈陽(yáng)性表達(dá)的卵巢癌ovcar-3細(xì)胞核周圍可見大量綠色熒光圍繞或黏附,而對(duì)ca-125呈陰性表達(dá)的卵巢癌skov-3細(xì)胞核周圍未見或僅見極少量綠色熒光。使用imagej定量分析結(jié)果顯示,ovcar-3腫瘤細(xì)胞的總超聲納米泡熒光強(qiáng)度與細(xì)胞熒光強(qiáng)度比值明顯高于skov-3腫瘤細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1.超聲納米泡造影劑的大小、穩(wěn)定性及超聲顯像效果適合作為血管外造影劑。2.通過edc與nhs將ca-125抗體結(jié)合到超聲納米泡表面,成功制備靶向超聲納米泡造影劑。連接ca-125抗體后超聲納米泡仍保持小粒徑和較高的穩(wěn)定性。4℃為保存靶向超聲納米泡的最佳溫度,于制備后三天仍可保持較小粒徑及良好的超聲造影顯像效果。3.在體外觀察靶向超聲納米泡的尋靶能力,發(fā)現(xiàn)靶向納米泡與相應(yīng)配體結(jié)合牢固,攜帶了CA-125抗體的靶向超聲納米泡在體外能高效、特異性地與CA-125呈陽(yáng)性表達(dá)的人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞結(jié)合,而與CA-125呈陰性表達(dá)的人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞不能結(jié)合或結(jié)合率極低。4.攜帶CA-125抗體的靶向超聲納米泡在動(dòng)物體內(nèi)超聲造影實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,靶向超聲納米泡可高效、特異性地聚集在靶區(qū),靶向超聲納米泡可以明顯增強(qiáng)CA-125呈陽(yáng)性表達(dá)的人卵巢癌OVCAR-3皮下移植瘤的顯像效果,可作為早期診斷卵巢癌的靶向超聲造影劑。5.病理切片經(jīng)熒光顯微鏡觀察并定量分析,結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)攜帶了CA-125抗體的靶向超聲納米泡能高效、特異性地與CA-125呈陽(yáng)性表達(dá)的人卵巢癌OVCAR-3腫瘤細(xì)胞結(jié)合,而與CA-125呈陰性表達(dá)的人卵巢癌SKOV-3腫瘤細(xì)胞不能結(jié)合或結(jié)合率極低。
[Abstract]:Objective : To prepare a novel ultrasonic nano - foam contrast agent targeting ovarian cancer by using CA - 125 antibody as ligand , and to evaluate its physical and chemical properties and its targeting to OVCAR - 3 cells expressing CA - 125 in ovarian cancer . The results showed that : 1 . The results showed that : 1 . The results showed that the average particle size of targeted and non - targeted ultrasound nanobubbles was 74.6 鹵 16.7nm , 66.6 鹵 22.0nm and 0.208 鹵 0.069 , 0.203 鹵 0.020 respectively .

【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R445.1;R737.31

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本文編號(hào)：1811469